如果流式筛选GFP阳性细胞内的敲除率那么高(16/18),单克隆扩增后是否可以直接裂解提蛋白,做WB验证呢?我不想知道编辑的碱基数和位置,只想知道蛋白敲除后细胞表型的变化?

查资料后发现“单纯用wb验证可能存在问题,因为cas9/sgRNA进行基因编辑时,可能通过切除非3倍数的碱基,造成移码突变,翻译出突变的蛋白,而抗体的原理是识别蛋白的某个序列或者某个空间构象。这样就算成功进行了基因编辑,WB时还可能造成抗体能够识别突变后的蛋白的情况,造成WT和KO的细胞系WB条带结果时无明显变化。” 而且抗体还存在非特性识别其他抗原的情况,你看到的蛋白并非你研究的目的蛋白。

201809091738389166.pdf

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