1.一种利用单克隆细胞分选快速获得CRISPR/Cas9基因敲除稳定细胞株的方法，其特征在于：包括如下步骤：

1)确定靶序列：在基因组数据库中找到目标基因DNA序列，然后使用软件CRISPOR获得目标基因的靶位点，选择两个特异性靶位点作为sgRNA靶序列；

2)设计引物：根据步骤1)获得的sgRNA靶序列分别设计引物，并在引物序列的5‘端添加BbsI酶切位点，得sgRNA引物；分别合成sgRNA引物；

3)获得双链的DNA片段：将步骤2)中合成的sgRNA引物组合后退火、磷酸化获得带有粘性末端的双链DNA片段；

4)获得载体DNA片段：使用BbsI酶切pX458质粒，回收线性质粒DNA，获得具有粘性末端的载体DNA片段；

5)获得Cas9-sgRNA表达载体：将步骤3)中得到的带有粘性末端的双链DNA片段分别与步骤4)中得到的具有粘性末端的载体DNA片段混合，加入T4DNA连接酶连接后转化大肠杆菌，培养后挑选大肠杆菌单菌落测序验证，正确的即为Cas9-sgRNA表达载体；

6)将两种Cas9-sgRNA表达载体等质量混合后，通过脂质体介导的转染方式转染细胞系，转染40-80小时后进行单克隆分选；

7)利用流式细胞仪进行单克隆分选，将荧光蛋白阳性细胞按照1个细胞分选到1个孔的方式分选到加了全培养基的微孔板中；进行分选时加Sytox blue核酸染料去除死细胞；

8)培养分选得到的GFP阳性单细胞，增殖后获取细胞基因组DNA；

9)设计包含靶位点目的片段的检测引物，以步骤8)得到细胞基因组DNA为模板进行PCR扩增；鉴定PCR扩增产物，选择CRISPR/Cas9基因敲除细胞株，扩大培养后冻存。