分类：实验技术

Isolation and Culture of Primary Human Gingival Epithelial Cells using Y-27632 | Protocol

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Isolation and Culture of Primary Human Gingival Epithelial Cells using Y-27632

DOI: 10.3791/62978

章节

0:00Introduction

0:49Gingival Tissue Pretreatment

1:13Digestion of Gingival Tissue

2:46Cell Passage

3:51Representative Results

6:18Conclusion

Summary


November 6th, 2021

Here we present a modified method for the isolation and culture of human gingival epithelial cells by adding the Rock inhibitor, Y-27632, to the traditional method. This method is easier, less time-consuming, enhances stem cell properties, and produces larger numbers of high-potential epithelial cells both for the laboratory and for clinical applications.

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从0到1：手把手教你设计繁育方案_搜狐汽车_搜狐网

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从0到1：手把手教你设计繁育方案


2019-01-17 17:00:00



基因敲除、条件性基因敲除、点突变、条件性点突变、基因敲入、人源化等等，各种类型的小鼠模型越来越多地被应用到生物医学研究中。同时，获得新的基因修饰小鼠也变得越来越容易。这让我们能够组合出更多全新的小鼠模型，让多种功能或多种遗传改变能最终在同一只小鼠上实现。比如，在一个A基因点突变的小鼠上敲除B基因、同时还带有另一种细胞示踪的荧光标记。

听上去很酷！仔细想想，这意味着需要将3种甚至4种小鼠品系交配到一起。真的繁育起来可就不是那么简单了，很可能会弄得手忙脚乱。

因此，制定一份有效的繁育方案显得尤为重要。怎么才能用最快的速度、最高的效率、最少的成本来获得自己想要的新品系呢？今天，我们就来详细分解。

基础：孟德尔定律与旁氏表

旁氏表（Punnett square），也叫棋盘法，是用于预测特定杂交或育种实验结果的一种图表，可以预测后代中拥有特定基因型的概率。

单基因杂交旁氏表示例

每个后代个体拥有基因型BB、Bb及bb的概率分别为25%、50%及25%。

双基因杂交旁氏表示例

推荐使用树形图，因为树形图对于双/多基因杂交的情况会更为直观、方便。

第一步：确定基因型

确定繁育方案的第一步，也是最关键的一步，是确定实验和对照组所需要的小鼠基因型。无论是只有单基因突变或者转基因，还是涉及到多个基因，都需要在开始繁殖之前清楚地明确自己的最终目标。

“在目标设定不明确时就匆忙开始进行繁育”这是非常不正确的做法，却又是很多同学容易犯的错误。这会导致很多后续的问题，比如：产生所需小鼠的比例过低、没有产生适合的对照小鼠等等。

今天，我们以常见的条件性基因敲除Cre-lox系统为例：

  • 实验组小鼠：flox（带有loxP位点的基因）纯合子，以及Cre杂合子
  • 对照组小鼠：flox（带有loxP位点的基因）纯合子，以及Cre阴性（野生型）

第二步：倒推法上溯繁育路线

确定了最终的小鼠基因型后，就可以倒推一代，找到一种最高效的终端交配方式，能够最大程度同时获得实验组与同窝对照组小鼠。

你可以这样考虑：

  1. 找到实验组与对照组之间的共有目标等位基因。如果可以的话，把这个共有目标等位基因变成纯合子。
  2. 分别对每个等位基因进行杂交，然后把它们合并起来。

以常见的条件性基因敲除Cre-lox系统为例：

实验组和对照组都是flox（带有loxP位点的基因）纯合子，因此flox就是共有等位基因。由于两组都需要flox纯合子，因此最高效的方式是通过flox纯合子来繁育flox纯合子。

对于Cre基因，我们需要Cre杂合子和不带Cre（阴性）的野生型。如果通过Cre杂合子与野生型交配，那么预期产生50％杂合子和50％野生型。

flox纯合子 X flox纯合子

Cre 杂合子 X Cre阴性野生型

如此，最高效的终端交配方式就是：

flox纯合子；Cre 杂合子 X flox纯合子；Cre阴性野生型

这样我们可以获得50%实验组基因型小鼠和50%对照组基因型小鼠（这里没有考虑小鼠性别）。

如果看过我们的繁育手册的童靴们可能要问了，为什么手册上没有直接画出这个高比例的方式呢？

原因是，这里flox纯合子；Cre杂合子基因型的小鼠既是我们最终目标的实验组，又是终端交配的亲代。而flox的基因在Cre重组酶作用后被敲除，可能已经产生了一些表型影响到生殖或发育，因此并不是每一种flox纯合子；Cre杂合子都适合用于作为繁育的亲代。

接下来继续向上反溯亲代的杂交方式，直到现有小鼠的基因型。通常来说，可以的话尽量获得并使用纯合子。这样既能高比例的获得带有突变的子代，又能减少繁育中使用小鼠的数量。

再次以Cre-lox系统为例：

  1. 将flox纯合子与Cre 杂合子杂交，可产生50% flox杂合子；Cre 杂合子。
  2. 将flox杂合子；Cre 杂合子与flox纯合子杂交，可产生25% flox纯合子；Cre 杂合子小鼠和25% flox纯合子；Cre阴性小鼠。

细心的你可能又发现了，这个图好像还是跟繁育手册上的不太一样嘛。为什么呢？

因为起点不同。这种最高效的繁育方式的起点是已经获得了足够数量的flox纯合子。flox纯合子又是怎么获得的呢？最初可以通过flox杂合子与flox杂合子交配，概率是25%。所以，如果以flox杂合子作为繁育的起点，那么flox杂合子；Cre 杂合子也可以通过flox杂合子与Cre杂合子交配获得，概率是25%。

我们再顺着捋一捋这个过程，就可以大致得到下面的这张繁育路线图：

当然这并不是唯一的繁育路线。事实上，繁育路线的选择还受到很多其它因素的影响，例如：

  • 在涉及两个以上基因的时候，要考虑到它们是否在不同的染色体上？如果在同一条染色体上，就可能会使繁育计划受限。
  • 如果某一种基因型由于突变的基因或插入的基因影响小鼠的生殖或直接引发致死，那么需要相应地调整亲代的基因型来避免繁育的中断。
  • 对于条件性过表达（Rosa26-LSL-geneX）这类小鼠模型，一般最终不需要flox纯合子；Cre杂合子，只需要flox杂合子；Cre杂合子即可。因此繁育过程会简单很多。
  • 对于利用广泛表达的Cre或生殖细胞表达的Cre与flox小鼠交配来获得全身性基因敲除小鼠，精子和/或卵母细胞中的flox序列会被Cre删除，并将删除后的等位基因传递给它们的后代。一旦证明Cre介导的序列敲除已经传递给下一代，最好通过繁育的方法把Cre基因从子代当中去除。

设计完繁育路线，我们就可以在此基础上大致估算需要使用的小鼠数量与整体规模。成本与预算也就基本心里有数了。

这里有几个系数会帮助我们估算完成整个繁育计划所需小鼠的数量。

估算公式：

如果您没有时间管理或易或难的育种项目，南模生物繁育服务可以帮您~ 我们的专业饲养与育种团队可以轻松、经济地为您管理您的小鼠，为您繁育新的品系、快速扩大种群规模、大量获得您需要的实验组与对照组。

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是时候介绍这套靠谱的低氧活细胞检测系统了_资讯中心_仪器信息网

是时候介绍这套靠谱的低氧活细胞检测系统了

2019/10/10 16:53:32
点击435次
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当地时间10月7日，瑞典卡罗琳医学院宣布，授予威廉·凯林(William G. Kaelin Jr)、彼得·拉特克利夫(Sir Peter J. Ratcliffe)及格雷格·塞门扎(Gregg L. Semenza)诺贝尔生理学或医学奖，以表彰他们在“发现细胞如何感知和适应氧气供应”领域的卓越贡献。


我们都知道，这次诺奖的核心发现就是围绕HIF-1（低氧诱导因子）这条信号通路，小编在这里不再赘述这条通路伟大而精妙的丰富内核，而要强调的是，人类的多种疾病都和常氧/低氧的调节有关，比如恶性肿瘤，肾性贫血，损伤修复，循环障碍疾病等，这次的三位诺奖得主已经为我们发现并阐明了生物体启动氧感知的重要钥匙，而仍然有太多未知的关键节点等待同道中人去探索发现。


常用的方法包括体外化学模拟和体外物理模拟，说白了就是给细胞加工具药物（例如CoCl2）或者是低氧环境培养。对于有些细胞模型或研究方向来说，低氧环境培养是必不可少的，然而往往很多实验室的低氧培养设备和其他检测设备是分家的，或者甚至缺少低氧培养的相关设备，给许多实验设计造成了不大不小的困扰。


点点点点一下嘛


Cytation & Lionheart氧浓度可调节活细胞检测系统

上图便是能够便捷控制CO2和O2的气体控制装置，在面板上可以方便设定CO2和O2的浓度范围，比如上图，O2的浓度已经从常规的20%降低到5%。是不是惊讶于她的轻盈体型？咱们就是这么节约空间资源有木有！


当然，作为控制器，是需要和咱们的核心检测设备Cytation或Lionheart搭载使用的，这样就能够完美实现低氧环境控制和灵活多样的活细胞检测同步进行（传送门）。



新鲜小案例：研究一下3D细胞球的缺氧变化


此前我们已经介绍过非常多的3D细胞的应用案例，由于3D细胞能够更好地模拟体内细胞的微环境，因此针对3D细胞培养的缺氧水平下的研究需求也是非常多的。


11个小时内，人源肝细胞球内的低氧水平逐渐增加（Cyto-ID Hypoxia 染料用于标记细胞内缺氧水平，红色荧光信号增加，表示细胞低氧状态加剧） 请向后滑动

通过Gen5软件的细胞圈选识别，可以对Cyto-ID标记的细胞缺氧信号定量分析。

这个图展示了不同的分析方式下的信号倍比变化，数据说明一切，咱们还是需要选择对合适的分析方法


使用低亲和力球形96板 ，能够快速的构建3D细胞模型（相关案例传送门），接入CO2和N2后，通过气体控制装置设定CO2条件5%，氧气条件8%，放入细胞培养板，即可在长时间内实时监测细胞球的形态或其他需要检测的指标。


来自霍普金斯医学院的案例


Dr. Gilkes团队的主要研究方向是低氧和乳腺癌的相关研究，2019年他们的一篇文章中通过3D组织细胞培养，阐述了低氧可激活RhoB的表达与活性，并且RhoB在乳腺癌的转移过程中发挥了复杂而关键的作用。


首先，Dr. Gilkes团队在分子水平，研究了多种乳腺癌细胞系在低氧（1%）培养条件下的HIF-1和RohB的mRNA水平及蛋白水平的表达变化，在发现显著差异后，当然是要研究一下这个关键的RohB在活细胞水平，特别是3D细胞培养模型中， 如何影响肿瘤细胞的表型变化，于是，Cytation和Lionheart就发挥了重，要，作，用啦。


比如，使用LionheartFX连续16小时检测基质胶3D结构中的MDA‐MB‐231亚克隆细胞的迁移运动情况，评价不同RohB的表达量对细胞迁移的影响。


16个小时，每隔2分钟拍照一次，然后软件合成视频，可以看出细胞的迁移运动情况，这个gif图是未处理的亚细胞克隆迁移情况。（请向后滑动）


另外，作者团队构建了3D细胞球的低氧培养模型，用于更深入的研究RohB对肿瘤细胞的迁移及侵袭能力的影响。这里恰好又使用了Cytation5的1%低氧及常氧培养系统，使用了针对3D细胞成像的Z-Stack模式。


3D细胞球在基质胶内的侵袭情况及定量统计。（请向后滑动）


在整体动物水平，Dr. Gilkes团队通过构建不同RohB表达量的患瘤小鼠模型，通过不同组织的HK2基因表达评估及免疫组化、HE染色等病理学评估，研究了RohB对于肿瘤病灶的生长和迁移的影响。其中大量的免疫组化及HE染色成像均由LionheartFX完成。有趣的是，研究结果发现RhoB对于肿瘤的生长和转移并非单一单向的作用，而是较为复杂的双向作用。


肝脏组织切片免疫组化对RhoB的表达定量检测，以及HE染色观察肿瘤转移病灶。（请向后滑动）

小鼠淋巴结组织切片的波性蛋白免疫组化，波形蛋白是肿瘤进展过程中的重要指标

到这里，我们可以看到，搭载了低氧活细胞培养的Cytation&LionheartFX细胞成像系统，可以从分子、3D细胞到整体动物水平帮助研究者获得多种多样的实验结果，其操作便捷性及提供数据的广泛性均极为出色。说到这，小编都有点嫉妒Dr. Gilkes团队的学生了，毕竟曾经的小编想做活细胞实验都是奢望呀，更何况是低氧模型的细胞追踪啦~


其实，低氧和氧感知研究还涉及到更多的实验类型，比如氧耗速率检测、氧应激检测、血管生成检测、信号通路研究相关检测、药物筛选方案等等，基于Cytation和Lionheart的图像采集、分析系统在这些领域都积累了丰富的应用，如果有感兴趣的童鞋可以随时和我们联系，或者持续关注我们的后续更新~

[来源：北京德泉兴业商贸有限公司]

标签：
细胞成像
北京德泉

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Win10利用更新将企业版转回专业版保留个人文件 | 软曼网

Win10利用更新将企业版转回专业版保留个人文件



2015-07-03 23:50 
阅读 108,187 次

评论 7 条

自从Windows 10发布以来一直都随着微软的发布更新而更新，从Win 10 10130版本发布大概两周的时间，截至到今天，微软在短短的4天内发布了3个版本的系统，Win 10 10158、Win 10 10159、Windows 10 10162版本，自己家的网速小水管，第一版还没下载完就出来第二版，在安装10159的时候，下载的是专业版安装包，但突然发现自己的系统不知道何时变成企业版系统，应该是之前激活时，使用了企业版的密钥导致。

因为企业版每次更新都是比较慢，没有专业版更新的那么及时，所以还是想重回Win10 专业版，同时还不想清空系统设置，和个人资料，所安装的软件等，所以考虑安全降级，保留所有内容，安全降级到专业版。经过此次的个人真实真机测试，完全通过，现在和大家分享下降级的方法。

注意：此方式只适用于升级更新方式的同时 企业版转回专业版

本人现在系统是Win10 10159 企业版本，下载了《Win10 预览版 10162 官方iSO镜像》专业版镜像文件。

然后打开-运行-regedit注册表

在注册表中查看HKEY_LOCAL_MACHINESOFTWAREMicrosoftWindows NTCurrentVersion 位置

如下是本人企业版的截图，部分内容已擦除

然后将这两处最关键的位置替换成专业版的信息两处红色框内容分别是” Professional ” 和 ” Windows 10 Pro Insider Preview” 如下图，点击进入大图模式

更改完如上注册表后，在运行，iSO包中的setup.exe  会弹出输入密钥，因为此10162版本均是专业版，使用企业版的密钥也不能够安装，提示密钥无效，必须用专业版密钥，如下图对比

▲上图是在Win10 10162版本中使用企业版密钥，不可用了

▲上图是在Win10 10162版本中使用专业版密钥，可以使用

点击下一步

稍等片刻就会变成如下图

此处可以看到，允许安装专业版Win10 和 保留所有设置，点击” 更改要保留的内容 “，会打开如下界面，此处在没有修改注册表的时候会直接进入到如下界面（但是因为本人忘记截不修改注册表时此界面的）相差就在第一个选项是不允许点击的，只允许第二、三个选择。

为了更直观的看是不是能够降级，在次截图如下对比

此时点击 ” 下一步 “或者是” 安装 “，进入安装界面，耐心等待，此处会在大概80%的时候比较长时间等待，需耐心。

电脑会在此后，重启数次，完成安装。剩下的就是耐心等待，大概30分钟-1个小时不等，从截图完成到发帖此刻，才安装进度到71%，估计还需要一段时间。

安装完系统信息如下，由原来的企业版 变成了 现在的 专业版，如需要激活请使用，专业版密钥 “8N67H-M3CY9-QT7C4-2TR7M-TXYCV”（估计用不到了，因为进入安装界面就已经输入了）

至此完整的Windows 10 企业版降级专业版保留数据完成，完美结贴。

历史上的今天:

本文地址：http://www.ruanman.net/archives/7443.html
版权声明：本文为原创文章，版权归 ﹖右掱邊﹎ヤ 所有，欢迎分享本文，转载请保留出处！

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Strategies to detect and validate your CRISPR gene edit

Strategies to detect and validate your CRISPR gene edit

Once you have carried out your gene editing experiment, how will you monitor the result?

You’ve chosen a CRISPR strategy to introduce a gene edit into your target cells. How will you verify and characterize the edit?

Depending on your experimental purpose and the nature of the gene edit, a variety of assays may be used, yielding various amounts and types of information.

This article summarizes the most commonly applied assays (Table 1), together with examples that apply them (see below, application examples A-J).

Table 1.

Method

Mutation type

Assay description

Application

Benefit

Limitation

A.

Mismatch detection assay 1,2

Insertion or deletion (INDEL)

Endonucleases such as T7 endonuclease I recognize structural deformities in DNA heteroduplexes. Cleavage fragments are separated by gel electrophoresis to determine DNA cleavage and gene editing %.

Rapid estimation of gene editing % in mixed populationsA,E. Identify most efficient experimental conditionsB. Screening single clones to further analyzeD,E.

Simple, cost effective.

No information on nucleotide sequence or functionality of targeted protein. Does not detect homozygous mutants. Not all mismatches are detected with same efficiency. Not amenable to high-thoughput experiments.

B.

RFLP

Insertion or deletion (INDEL), single nucleotide polymorphisms (SNPs)

RFLP=Restriction Fragment Length Polymorphism. SNPs or INDELS that create or abolish restriction endonuclease recognition sites are amplified by locus-specific PCR primers. Following restriction digest, cleaved fragments are fractionated by gel electrophoresis into readily distinguishable patterns.

Rapid estimation of HDR % in mixed populationsA,C. Identify most efficient experimental conditionsC. Screening single clones to further analyze by sequencing.

Simple, cost effective. Detects SNPs and homozygous mutants.

Requires restriction site polymorphism. No information on nucleotide sequence or functionality.

C.

Sanger sequencing

All

Genomic DNA surrounding putative mutation site is amplified by DNA sequencing.

Analyze the genotype of your single cell clones, such as allelic frequency and sequence of the editE,G.

Information on nucleotide sequence of each allele.

No functional information. Time consuming.

D.

Western Blot

Insertion or deletion (INDEL), single nucleotide polymorphisms (SNPs), reporter genes

Cellular proteins are extracted and separated by polyacrylamide gel electrophoresis, then transferred to a membrane and hybridized to protein-specific antibodies.

Monitor the protein expression levelA,E.

Demonstrates likely protein knockout.

No information on nucleotide sequence. Absence/presence of protein detection does not always correlate with functional state. Requires specific antibodies.

E.

Phenotypic assay

All

A variety of assays often specific to the target gene or cellular pathway, e.g. monitoring enzymatic activity, cell surface markers, apoptosis or fluorescent reporters.

Monitor or characterize phenotypic changes in the knockout cell lines and their biological relevanceF, G,H,I,J. Identify most efficient conditionsF. Select clones that show desired phenotypeG,J.

High throughput possible. Functional information. Biological relevance.

No information on nucleotide sequence.

F.

NGS

All

Genomic DNA of clonal cell lines is sequenced in high throughput.

Analyze the genotype of your cells, such as allelic frequency and sequence of the editI. Identify off-targets. In context of a pooled CRISPR screen, identify enriched or depleted genes in a cell population.

High throughput, information on nucleotide sequence

No functional information.

G.

TIDE3

Insertion or deletion (INDEL)

TIDE software employs the decomposition algorithm that quantifies identifies and frequencies of the predominant types of insertions and deletions in the DNA of a targeted cell population based on quantitative sequence trace data from two standard Sanger sequencing reactions of PCR amplicons of edited and control (unedited) samples.

Estimation of gene editing % in mixed populations and indel sizes.

Cost effective, gives an idea of spectrum of indels.

Doesn’t resolve large deletions, doesn’t work well with lower quality sequencing runs.

Application examples

Fluorescent Cas9 mRNA for enrichment ofCRISPR-mediated knockout and knock-in using synthetic guide RNA
  • A demonstration of the use of Edit-R Fluorescent Cas9 Nuclease mRNA and synthetic guide RNAs for enriching knockout and knock-in gene edited cells.
Optimization of reverse transfection of Dharmacon™ Edit-R™ synthetic crRNA and tracrRNA components with DharmaFECT™ transfection reagent in a Cas9-expressing cell line
  • Maximize success of your arrayed synthetic crRNA knockout screen with careful transfection optimization, editing efficiency and phenotypic readout.
Homology-directed repair with Dharmacon™ Edit-R™ CRISPR-Cas9 reagents and single-stranded DNA oligos
  • Create precise insertions using the homology-directed repair (HDR) machinery with a single-stranded DNA donor.
Microinjection of zebrafish embryos using Dharmacon™ Edit-R™ Cas9 Nuclease mRNA, synthetic crRNA, and tracrRNA for genome engineering
  • Successful gene editing in Zebrafish embryos, as confirmed by T7EI mismatch assay and fluorescent readout.
A CRISPR-Cas9 gene engineering workflow: generating functional knockouts using Dharmacon™ Edit-R™ Cas9 and synthetic crRNA and tracrRNA
  • Example of gene engineering workflow from delivery of CRISPR-Cas9 reagents to clonal cell isolation and characterization using the Edit-R gene engineering platform.
Optimized HDR-mediated fluorescent protein knock-in in K-562 cells using Edit-R™ CRISPR-Cas9 reagents and electroporation
  • A suggested protocol optimizing delivery of the HDR reagents in difficult to transfect K-652 cells using an electroporation method.
Fluorescent tagging of an endogenous gene by homology-directed repair using Dharmacon™ Edit-R™ CRISPR-Cas9 reagents
  • Tagging the endogenous SEC61B gene using an EGFP donor plasmid.
Using machine learning to identify the best CRISPR-Cas9 targets for functional gene knockout
  • High-throughput phenotypic analysis of CRISPR functionality.
Identification of genes involved in cell cycle regulation using arrayed synthetic CRISPR RNA libraries in a multiparameter high-content assay
  • An arrayed synthetic crRNA screen targeting cell cycle regulation genes with multiparametric, high-content phenotypic analysis on the IN Cell Analyzer 2200.
High-content analysis screening for cell cycle regulators using arrayed synthetic crRNA libraries
  • An arrayed crRNA screen identifies genes involved in different phases of the cell cycle

Summary

For most purposes, validation and characterization of edits on both the molecular and phenotypic level, will be required to assess their biological relevance.

For genomic screening purposes (application examples B, H, I, J), a phenotypic assay may be a good starting point to rapidly screen gene edits that show a desired phenotype.

DNA mismatch assays, TIDE, RFLP, or phenotypic assays are often applied as starting points to assess the success of the CRISPR experiment and screen positive clones with desired knockout or knockin mutations. Usually this first step, will be followed by more in-depth characterization of the nature of the edit on the sequence level, as well as on the functional level.

Hence, in a typical gene editing experiment, a multitude of assays will be applied successively (See application examples above).

References

  1. R. D. Mashal, J. Koontz, J. Sklar, Detection of mutations by cleavage of DNA heteroduplexes with bacteriophage resolvases. Nat Genet 9, 177-183 (1995).
  2. L. Vouillot, A. Thelie, N. Pollet, Comparison of T7EI and surveyor mismatch cleavage assays to detect mutations triggered by engineered nucleases. G3 (Bethesda) 5, 407-415 (2015).
  3. E. K. Brinkman, T. Chen, M. Amendola, B. van Steensel, . NAR 42, Issue 22, Pages e168 (2014).

Author: Kathrin Kerschgens Ph.D. | Project Manager Cell Line Engineering

Additional Resources

CRISPR-Cas9 Gene Editing Applications
  • CRISPR-Cas9 systems can be used with custom RNA guides for several gene editing applications.
Resources – Gene Editing
  • Find product guides, FAQs and more.

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间充质干细胞成骨及成脂诱导培养基标准制作方法-百度经验

1.配置FBS10%含量的HG-DMEM培养液；

2.在配制完成的HG-DMEM培养液中加入1μM地塞米松,10μg/ml胰岛素，200μM吲哚美辛和0.5mM IBMX；

3.准备6孔培养板，将P4细胞按照2×104个/平方厘米的规格接种于原始HG-DMEM培养液中

4.待细胞长至基本融合后，更换上述制备完成的成脂诱导培养液培养2天，在用只含有10μg/ml胰岛素的成脂维持培养液培养1天，如此交替循环培养至14天，使用红油O染色。

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异位成骨动物模型的研究进展_异位成骨_皮下_肌袋_医脉通

异位成骨动物模型的研究进展

2015-04-04
来源：中国矫形外科杂志
关键词：
异位成骨
皮下
肌袋

作者:南京医科大学 朱彦丞

近年来随着骨组织工程学的迅速发展，应用骨组织工程技术治疗骨缺损为当前发展趋势，异位成骨动物模型相对于原位成骨可以减少实验中影响成骨的变量，能评估成骨干细胞、成骨诱导材料的效果。异位成骨动物模型的建立方法从最早的皮下和肌肉小袋植入模型，到后来的肾被膜植入以及腹腔内植入模型，各有特点，选择一个合适的模型对实验的成功有着密切的关系。本文将对异位成骨动物模型的研究进展作一综述。


皮下植入模型


皮下植入模型操作方法简单，应用最为广泛。模型可选择的动物大到猪、犬，小到兔、大鼠、小鼠，目前应用最广泛的是鼠类。皮肤切口的选择在背部，不仅植入空间大，而且鼠不容易触碰到伤口的缝线，有利于切口愈合，若行对照实验，可在背部对侧皮下植入作为对照。


Kasten等为比较修饰后生长分化因子5(GDF－5)与原生GDF－5及骨形态生成蛋白2(BMP－2)的成骨能力，将分别含有修饰后GDF－5、BMP－2以及原生GDF－5的磷酸三钙材料植入24只小鼠背部皮下区域，4周后测量ALP含量比较早期成骨情况，得出修饰后GDF－5与BMP－2成骨能力差异无统计学意义，但均优于原生GDF－5的结论。考虑到小型猪的骨再生率与人类接近，Metzler等选择35只小型猪为实验对象，切口选择在猪的椎旁皮下区域，用以模拟人类骨再生模型比较富血小板血浆(PＲP)对植入牛属羟基磷灰石(bHAP)、藻类羟基磷灰石(pHAP)、生物玻璃(BG)骨替代材料成骨效果的影响，结果提示PＲP对bHAP及pHAP成骨能力提高显著，BG实验组及对照组均未见有异位成骨出现。骨髓间充质细胞(BMSCs)作为一种多能干细胞是经典的植入细胞，但单纯干细胞植入效果往往不佳，尤其在皮下植入模型，所以常常联合羟基磷灰石、磷酸三钙、聚己内脂等支架材料和BMP等细胞因子加以诱导，Noshi等将多孔羟基磷灰石材料(HA)、HA/BMP、HA/MSCs及HA/MSCs/BMP分别植入大鼠皮下，结果显示HA和HA/BMP组未见类骨质形成，HA/MSCs组在植入4周后可见新生骨出现，而HA/MSCs/BMP组则在2周后即可见明显的新骨生成，4周后新骨形成量及范围更大，提示三者联合使用能够更大程度地促进诱导成骨。


采用皮下植入模型的一个缺陷是由于皮下组织松弛，植入物有游离的可能，尤其在使用大型动物且时间跨度长的实验中更容易发生。成骨产物与周围组织外观类似使产物更难分辨，进行适当的标记可以有效解决此类问题。解芳等采用荧光染料CM－Dil标记BMSCs与TCP复合植入比格犬背部皮下，8周后取材行组织学检测，HE染色后可见支架孔隙中有类骨基质沉积，使用荧光显微镜可观察到标记细胞的存在。此外皮下植入异位成骨相比于其他部位异位成骨模型在成骨能力上较差。


Yoshida等通过比较在20只Wistar大鼠的皮下与肌肉内分别植入以I型胶原为载体的rhBMP－2的成骨情况，在术后1、3、7、21d测量皮下与肌肉的碱性磷酸酶及钙含量评估初期成骨，结果显示术后第7、21d肌肉的碱性磷酸酶与钙含量均高于皮下，提示皮下的成骨环境要差于肌肉内。这种差异的产生一般认为是皮下的氧压、血供即细胞生长环境不及肌肉，此外肌肉本身含有未分化成骨干细胞，在成骨环境中容易分化为成骨细胞诱导成骨，而皮下则缺乏此类细胞。然而，也有学者观察到相反的结果，Gotz等将羟基磷灰石支架植入于哥廷根小猪的皮下和肌肉中，在植入10周，4、8个月后经组织学测量显示植入皮下的新生骨构成比要比植入肌肉的多，提示皮下植入成骨要比肌肉明显，但作者考虑可能是羟基磷灰石颗粒在肌肉中的生物力学作用抑制了异位成骨的形成所致。有学者研究发现即使不加入干细胞，仅植入成骨诱导因子及支架也可以诱导成骨，考虑可能是由于皮肤损伤可以导致循环内皮祖细胞的聚集所致。


肌袋植入模型


肌袋植入模型应用于犬、山羊、兔子等动物的研究较多。体型较小动物植入部位的选择大多在后肢的大腿或臀部肌群处，而在犬、山羊等大型动物，则多选择背部，竖脊肌、斜方肌常为植入部位。Wang等为研究羟基磷灰石支架多孔结构的成骨能力，选择2岁龄的犬为研究对象，在背部T8～L5处作一脊柱旁平行切口，暴露肌肉并钝性分离出数个肌袋后植入支架材料。肌袋植入成骨技术成熟，在人体也有着临床应用案例，Warnke等在2004年使用计算机3D打印技术模拟出患者缺损的下颌骨模型，将钛网制成相匹配的支架，进而将含有骨矿石、自体骨髓和骨形态生成蛋白－7(BMP－7)的钛网支架植入患者的背阔肌，4周后进行放射性元素锝99骨扫描和胸部CT检查，结果均提示在植入部位有骨组织形成，7周后成功诱导成骨并进行游离骨皮瓣手术修复了下颌骨缺损，术后4周患者可以进行少量咀嚼活动。

Heliotis等在未使用骨髓或成骨干细胞情况下，仅将羟基磷灰石支架和BMP－7植入患者左侧胸大肌内，3.5个月后经锝99骨扫描提示在支架区域内可见骨生成，6个月后将获得的成骨组织移植于患者左下颌骨进行替代，行组织切片检测显示骨含量达17%。骨骼肌中存在2种成体干细胞类型:骨骼肌卫星细胞和肌源性干细胞，体内外实验均显示这2种干细胞在一定环境条件下具有分化成肌、骨和脂肪组织的能力。Lai等利用胶原载体和人类重组骨形态生成蛋白－2在未加入干细胞的情况下，成功地在大鼠骨骼肌袋中诱导成骨，表明肌肉内存在干细胞，并可被诱导分化成骨。

但Hao等分别将多孔磷酸钙材料(pCPC)及多孔磷酸钙复合山羊牙髓干细胞(SGDs－pCPC)植入山羊背部肌袋分组，在2、4、6、8周后未加入干细胞的pCPC分组中并未检测出新生骨，而SGDs－pCPC分组第2周开始即见少量类骨组织出现，且随时间增加类骨组织更多，同时可见血管样物质生成。可能是不同的支架植入及未有成骨细胞因子的应用导致了相反的实验结果。但同样因为肌肉组织内富含成骨干细胞所以在相同的诱导条件下能够得到更多的成骨量，且骨骼肌内血运丰富，更有利于细胞的增殖，因而成骨能力强。Yang等在以猪和狗为实验对象上的研究显示在肌肉内异位成骨45d即可被组织学上观察到，而皮下植入成骨则需要60d。需要注意的是有研究显示当肌肉损伤后，BMP信号通路会上调。在应用肌袋植入模型时，BMP信号的上调会促成骨因素的产生，可能影响研究结果。因此钝性分离肌肉，避免肌纤维的损伤可以较大程度避免该因素的干扰。


肾被膜植入模型


肾被膜植入模型因为其操作的复杂性所以在实际应用中并不广泛。模型一般使用鼠类，在其肾被膜处钝性分离出一小袋状，将植入物放入。采用袋状放置植入物，考虑可以一定程度避免植入物的移位、游离。要注意保持肾被膜的完整性有利于确保植入物放置在位且可促进成骨血管化。此外还有用穿刺的方法直接将细胞打入肾被膜内，但成功率较开放植入降低。王娟等将人脐带MSCs注射到BALB/c裸鼠肾被膜下，3个月后人脐带MSCs仍为梭形排列，未见类骨质，无明显淋巴细胞浸润，可能系植入干细胞的密度稍低所致。


肾被膜植入模型的一个优势在于此区域血流丰富，因而植入物相比于血运营养少的皮下更易成活，细胞增殖快，实验的时间跨度也可以较短，更易形成血管化，植入体在被血管化后，才能继而自体化，与自体组织相容。有文献报道植入肾被膜区域的组织和器官有免疫隔离作用，发生免疫排斥反应少，可以被称为免疫赦免区，是异体成骨培养的良好场所。此外，因为肾被膜区域几乎没有成骨干细胞，因而当植入后有成骨，则几乎可以肯定的认为成骨产物是由植入物分化或增殖而来，避免了内源性干细胞对实验的干扰。当然，肾被膜植入模型也有局限性，因为实验动物一般为鼠类，小鼠的肾被膜组织薄，容易破裂，植入物可能游离于腹腔内，造成实验失败。且若植入小鼠肾被膜中，植入物的尺寸会受到限制，目前肾被膜植入异位成骨模型大多用于牙胚组织的研究。Zhang等为研究含rhBMP－2的β－TCP支架对牙组织形成的作用，将牙胚细胞及含rhBMP－2的β－TCP支架植入大鼠的肾被膜下，与仅植入牙胚细胞和仅植入支架的大鼠进行对照，得出了含rh-BMP－2的β－TCP支架对牙组织形成有诱导作用。


腹腔内植入模型


腹腔内血运丰富，适宜细胞生长，空间广泛成骨量大，植入操作步骤不复杂，并且将材料植入体腔内壁层腹膜、腹腔大网膜等延展性可能更好、临床适用性更强，因而腹腔是不错的异位成骨植入部位。但目前关于此方面的研究报道仍然较少，可能是腹腔内强烈的免疫排斥反应限制了其应用。Duailibi等将牙胚细胞及支架材料植入近交系Lewis大鼠网膜内模拟牙组织体内发育过程，12周后成功得到牙齿组织。近交系可以一定程度上避免排斥反应，但是近交系动物实验成本高，难以满足大样本的实验研究。


于金华等将封闭群SD幼鼠牙胚分别植入SD成年鼠的肾被膜下、肠系膜内、腹膜外间隙、腹腔内和口腔黏膜下进行比较，3周后发现仅在肾被膜下及肠系膜内牙胚生长分化良好，在腹膜外间隙和腹腔内发现有大量淋巴细胞浸润，他们认为可能系因为该处同种异体移植物免疫排斥反应严重导致。而黄鹏等在狗的腹腔内大网膜下植入羟基磷灰石多孔材料并未见骨细胞生长，考虑是因为网膜包裹了支架不利于组织液的进入和血管的生成，且网膜可能过滤了血液中的某些成骨成分导致成骨诱导效果不理想。既往研究中，也有学者未观察到免疫排斥反应发生，Shin等考虑到网膜内区域血液丰富，为构建血管化骨组织，将新生鼠MSCs与静电纺丝多孔材料支架植入大鼠网膜内，4周后取植入部位组织进行组织切片、免疫组化以及扫描式电子显微镜检测，结果均提示有类骨组织贯穿整个支架。


讨论


异位成骨模型在骨组织工程学的研究上有着十分重要的地位，目前皮下植入，肌袋植入、肾被膜下植入异位成骨模型技术已经相对成熟，各有其优缺点，腹腔内异位成骨模型还有待进一步研究。未来将进一步建立理想的异位成骨动物模型，为新材料的动物实验验证提供更为可靠的依据。

 

来源：中国矫形外科杂志2015年3月第23卷第6期

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