(1) Does anyone have IHC Profiler experience?

(1) Does anyone have IHC Profiler experience?

September 7, 2018
Hi Alison,
Another student in our group was working with this program recently. My understanding of “positive/low positive” categories is that they are arbitrary divisions of the intensity values – so they may not be appropriate objective metrics depending on y​o​
… 
January 18
Hi Alison,
I have found the same problem. I’m analysing soft tissue slide and some of positive control slide not result positive with the IHC Profiler. How did you solve it?
Elvan Wiyarta added an answer
February 10
Hi Alison,
I also experienced the same thing in the past. Do you do an individual analysis of each image? If so, sometimes individual analyzes can produce errors like this. I also don’t understand why this error can occur. However, I have a solution to avoid this error with batch processing.
Batch processing is a mechanism within ImageJ that allows users to perform multiple image analysis at once. To do so, try to follow my protocol:
1. You need to prepare the image that you will process. This means that you need to “crop to a region of interest to exclude background” on all images first.
2. After all the images are ready. Put the image in one or more folders according to your needs.
3. Click Process> batch> macro and the batch process window will appear.
4. Select the input folder containing the image you wish to analyze. Remember, you can only batch process one folder at a time! So if you are working in multiple folders, you need to do batch processing equal to the number of your folders.
5. Select the output folder where you want it. Basically, this output folder will contain the logs and histograms of the analysis of all the images in your input.
6. Set the output format according to your needs. I usually don’t change the settings for “output format”, “add macro code”, and “file name contain”.
7. Under the file name contains, there will be a large empty space. It’s where you put your batch processing code. Each protocol has a different code. I have coded your protocol as the following:
run (“IHC Profiler”, “mode = [Cytoplasmic Stained Image] vectors = [H DAB]”);
8. After that click process, than the log and histogram window will start batch processing all the images in your input file.
This batch processing has two advantages. The first is to streamline your work on image analysis. Second, for some reason, if you use this batch processing, the error that you asked about earlier will not occur.
I hope my answer helps. I’ve also included my publications if you’d like to read more ( https://www.phcogj.com/article/1326 ). Contact me if you have further questions. Cheers!

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ImageJ实用技巧——免疫组化分析(定量分析篇) – 知乎

ImageJ实用技巧——免疫组化分析(定量分析篇)

北漂4年,沪漂ing

在临床病理诊断中, 免疫组织化学( Immunohistochemistry, IHC) 是一种很重要的技术和手段。

免疫组化标记时细胞阳性着色程度取决于抗原含量、分布密度和标记方法及其敏感性。

一般而言,抗原含量越多,分布密度越高,阳性结果显色则越强。根据阳性标记的显色程度分为:蓝色,阴性;淡黄色,弱阳性;棕黄色,中等阳性;深棕色,强阳性。

免疫组化原理图

免疫组化分析主要有两种方法,阳性着色细胞计数法和染色强度评分法。前者是在光学显微镜下,随机多个视野下计数阳性着色细胞;后者则是在下按染色强度和染色阳性范围评分,最终分数相加。

但组织样品的病理学分析仍然是耗时且主观的程序,其中人工判断染色强度来评分,直接受到视觉偏差的影响[1]。且阳性细胞计数往往不能自动化进行,导致免疫组化分析费时费力。


这篇文章会怎么利用ImageJ进行免疫组化分析,进行全面的讲解,包括两部分:

1、利用IHC Profiler插件对样本的染色情况进行自动化评分;

2、利用Trainable Weka Segmentation插件分别对阳性细胞和阴性细胞进行计数;


一、IHC Profiler-自动分析染色情况

IHC Profiler,将阳性细胞的平均灰度值(染色强度)和阳性面积百分比(染色面积)共同作为 IHC 测量指标[2],最终给出四种评分:High positive (3+), Positive (2+), Low Positive (1+) and Negative (0)。

1、插件安装

注意:Fiji和IHC Profiler会出现不兼容的情况,导致结果错误,建议在ImageJ1中安装这个插件并使用。

ImageJ1的下载链接:

https://imagej.nih.gov/ij/download.html

该插件的安装包括插件和宏的安装,下载地址:

IHC Profiler​sourceforge.net

若无法打开可以在GitHub上下载到:

https://github.com/inanezhao/ImageJ-Tutorial/blob/master/IHC_Profiler.zip

压缩包里包含下面三个文件插件文件夹、宏文件以及官方安装教程:

(1)插件安装

将IHC Profiler文件夹放在Plugins中,重启ImageJ即可安装IHC Profiler插件:

(2)宏安装(对于Fiji是必需且重要的)

Fiji安装宏的步骤和网传的版本不同,因为IHC Profiler是基于ImageJ最初的版本编写的,在FIji上使用的时候会有不兼容的情况。

首先将IHC_Profiler.txt文件放到macros文件夹中。

然后点击Plugins -> Macros -> Install,选择该txt文件(如果是ImageJ1则跳过这一步)

即可在Plugins -> Macros中找到该宏:

注意!!!每次关闭ImageJ后,再次使用IHC Profiler需要重新安装该宏。否则得出的结果是错误的。

2、插件使用

该插件的基本原理为先对染色图片进行颜色去卷积,分出蓝色的阴性区域和棕色的阳性区域,然后判断染色类型是细胞质染色还是细胞核染色,再分别进行对应的操作[2]。

插件工作流程

(1)以细胞质染色为例:

打开图片和插件(Plugins -> IHC_Profiler)

打开插件后选择细胞质染色的Mode:

颜色去卷积默认H DAB染色:

然后即可分别得到阴性区域和阳性区域,直接得出结果:

(2)以细胞核染色为例:

选择细胞核染色Mode,并不会直接得出结果,需要先设定一个阈值:

然后点击上面安装的宏(Plugins -> Macros -> IHC_Profiler),即可得到结果:


二、Trainable Weka Segmentation-自动阳性细胞计数

该插件的使用请参考这篇文章:

一般的免疫组化图片不能通过Threshold的方法进行分割,需要利用该插件,基于机器学习算法,做到阳性细胞和阴性细胞的计数。

例如统计上图中,阳性细胞和阴性细胞的数量,经过训练之后分类器可以很好的分出阳性细胞、阴性细胞以及背景(甚至可以区分出强阳性和弱阳性细胞):

点击Create result、Get Probability可以得到分割后的图像:

通过Analyze Particles可以快速得到细胞的数量,可以参考这篇文章:

三、总结

该篇文章完整讲述了怎么利用IHC Profiler进行免疫组化分析,补充了利用Trainable Weka Segmentation对阳性细胞进行自动统计。

以后对于免疫组化分析,不必再过度依赖人工,可以通过软件的自动分析得到更加直观和稳定的数据。但前提是样品的制备、染色以及拍照时要注意避免假阳性。

与此同时,在使用插件的时候要多思考,多研究,避免出现分析错误的情况。(例如,若不安装IHC Profiler的宏文件,得出的结果会完全相反)

推荐阅读介绍IHC Profiler的这篇文献[2],以更深入地了解自动免疫组化分析的原理。

四、补充

(1)插件报错问题

如果插件出现报错等不能用的情况,建议换用ImageJ1来安装这个插件,在ImageJ1中使用,而不是Fiji。

(2)共染问题

免疫组化共染不能用IHC Profiler来进行分析,这个插件现在只包含了DAB。

如果想要分析共染的荧光强度的话,比较好的方法是通过Colour Deconvolution(Image -> Color -> Colour Deconvolution)

选择H&E DAB把粉红色、棕色以及蓝色,三个通道分别分离出来(但要注意免疫组化本身并不是化学计量的)。

通道分割结果

可以参考下面这个网站:

Colour-deconvolution​blog.bham.ac.uk

参考文献:

[1].Jensen, Ellen C . Quantitative Analysis of Histological Staining and Fluorescence Using ImageJ[J]. The Anatomical Record, 2013, 296(3):378-381.

[2].Varghese F, Bukhari A B, Malhotra R, et al. IHC Profiler: An Open Source Plugin for the Quantitative Evaluation and Automated Scoring of Immunohistochemistry Images of Human Tissue Samples[J]. Plos One, 2014, 9(5):e96801.


如果对于ImageJ使用有什么问题可以私信我,或者给我发邮件:zhaoyc9@163.com

更多教程可以关注我的专栏:

希望对大家有帮助~

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【免疫组化分析法】色彩分割+机器学习! – 云+社区 – 腾讯云

【免疫组化分析法】色彩分割+机器学习!

2020-09-23阅读 4620

聊点学术

免疫组化定量分析是科研人的传统艺能!之前,个人一直推荐采用Image Pro Plus (IPP)进行测量。

IPP测量时对染色效果要求较高。其原理是在HSI模式下,通过参数设定或调节直方图波形曲线的方法来选定阳性表达区。详情见→【聊点学术】既往精彩原创汇总

当背景染色较强或者细胞核较多时,上述方法操作起来比较费力。

(背景染色太深)

(细胞核多)

今天要说的是基于Image J的 “色彩分割法机器学习”进行免疫组化定量分析。关键插件为IHC Toolbox,由英国诺丁汉大学的两位大牛开发。

原理1: 自动化将棕色(DAB)和蓝色(苏木素)色彩分割,这样就可以直接快捷地测量阳性区。

原理2:机器学习模式帮助image J精准识别阳性表达物(棕色)

图文教程

1. 下载安装FiJi版本image J,接下来要用到其中的插件IHC Toolbox ,否则无法进行后续操作。

(image J开源软件下载地址:https://imagej.net/Fiji) (IHC Toolbox下载地址:https://imagej.nih.gov/ij/plugins/ihc-toolbox/index.html)。

2. 将下载好的IHC Toolbox插件复制到fiji安装位置的plugins文件夹。重启软件之后就可以在plugins中找到IHC Toolbox插件了。

3. 打开一张IHC图片,然后点击plugins,选择IHC Toolbox。

4. 在弹窗中先选择自带的H-DAB(即苏木素-DAB),然后再点击color。

5. 此时就获得了分割后的图像。可以看到右图所有的蓝色已基本被去除。

6. 如果对插件自带的H-DAB色彩分割不满意。此时,可以点击左侧的Training,鼠标光标会变成十字架。

7. 然后在原图中拉一个矩形框选阳性区时会跳出弹窗,觉得有小误差可以拉动滑条调整。确定好之后点击collection。

【机器学习】重复在此图或者同批次的其它图片上进行此步骤操作,每做完一次就点击collection。一般操作约5-10次左右插件即可完成学习。然后点击Save_Model保存,所有学习内容会自动默认到H-DAB模式中,后续测量直接调用H-DAB即可。

本文分享自微信公众号 – 聊点学术(SingForScience),作者:Mark

原文出处及转载信息见文内详细说明,如有侵权,请联系 yunjia_community@tencent.com 删除。

原始发表时间:2020-09-13

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科学院博士手把手教你做免疫组化定量分析

科学院博士手把手教你做免疫组化定量分析

2017-12-03 07:00

做个生物实验也是够苦逼的啊,不止结果要好看光鲜,还要做定量……也是醉了。明明 western blot 结果做的那么漂亮,一眼就看出来差异了,还需要定量?!思量起来,这个也还算简单,忍了吧。。。

but…辛辛苦苦做的免疫组化(或荧光)也需要定量——你当搬砖就可以随便使唤了吗?花花绿绿,斑斑驳驳,肿么分析

还好,我有这本秘籍,一定要看完哦。

进入正题

准备工作

首先,你需要下载 imageJ,然后下载 IHC-Toolbox 插件,并放入 imageJ 的安装目录下的 plugins 文件夹下;

送链接:https://imagej.nih.gov/ij/plugins/ihc-toolbox/index.html

开始分析

1. 在菜单栏里选择文件打开,打开实验数据图片(此处所使用图片来自互联网,大家可用自己的数据实战);然后在 plugins 菜单下 → 选择 IHC Toolbox,打开如下:

2. 选中感兴趣的区域(ROI),然后点击 Training;(这里选择的区域一定要有代表性,范围不可太大,也不能太小)

3. 上步完成后会弹出 Color Chooser 窗口,滑动滑块儿以使感兴趣的区域全部被选中;

4. 调整图片格式,改成 8 bit 灰度图片,彩色的好看但是不支持哦;(你也可以改成 16 bit 的哈,忘了修改软件会蹦出提示的)

调整完后,大概就是酱纸。

5. Image → Adjust → Threshold… 打开调整阈值窗口;

6. 滑动滑块儿使红色覆盖所选区域,其实就是告诉软件你要分析哪些区域,有点像 ps 中的魔棒?… 反正赶脚很傻瓜;

7. 然后就到了黎明前的最后一哆~嗦~了,告诉软件你要分析面积还是灰度值,此处我们以面积为例(一定记得要选中 limited to Threshold 哦,切记!切记!)不蓝,分析的是整个图的面积,就是整个图片的像素长宽之积:1392 x 1040

8. 最后一步就是出数据来 Analyze → Measure,也可以用快捷键 Ctrl + M,然后保存数据就好了,是不是既简单又实用呢?

第一次写教程,心里还有点忐忑呢,没有说清楚的地方希望大家留言交流。你的支持就是我最大的动力。

相关实验 protocol

WB 转膜条件推荐

WB 详解(原理、试剂、步骤)

WB 过程中常见问题及建议大汇总

老方法 WB,如何成功优化?

蛋白质 WB 低成本快速半干转印方法

快戳阅读原文查看

作者:wangnan235

图片来源:wangnan235

题图来源:丁香通返回搜狐,查看更多

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科学网—转录因子富集分析 – 马省伟的博文

转录因子富集分析

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2018-11-13 22:23

|系统分类:科研笔记|
小麦, 富集分析, 转录因子

转录因子富集分析

转录因子因子富集分析背后的原理与GO,KEGG等富集分析是一样的。

这里还是使用Y叔的R包“clusterProfiler”。

首先我们要知道哪些基因是转录因子,并且属于哪一个转录因子家族。这个信息可以在这里下载(https://pan.baidu.com/s/12Zi-FvySMuaWyM2b9_2yuA)。这个文件中只需要两列,一列是转录因子家族的名字,一列是基因的名字。根据这个文件,整理出共有多少个转录因子家族,并给每个转录因子家族一个唯一的编号。将编号和名字存入一个新文件。

上面是所有转录因子,首先要筛选出在我们样品中表达的转录因子。

其次需要确认差异表达的转录因子。

最后需要一个转录因子编号和名字的对应文件。

样品中表达的转录因子,输入格式如下:共两列,第一列是转录因子家族编号,第二列是基因ID。其中编号是根据刚刚下载的文件整理而来。即一个基因家族有唯一一个编号。

差异表达的转录因子,输入格式如下:只有一列,基因的ID

image-20181113214653231

还需要是一个转录因子ID和名字的对应文件,输入格式如下:

准备好之后,直接套用GO分析的代码就好。

#设置工作目录
setwd("/Users/markdown/6DS/RNA-seq/DEG3")
#加载需要的R包
library("clusterProfiler")
library(ggplot2)
library(stringr)
#读入差异表达的转录因子,注意这里分隔符是"t",默认没有表头。如果是逗号分隔符请使用sep=","
gene <- read.csv("NS1vsCT_DEG_TF_list.txt",header=FALSE,sep="t")
gene <- as.factor(gene$V1)
#读入在样本中表达的转录因子,这一部分即是背景基因
term2gene <- read.csv("NS1vsCT_DEG_TF_background.txt",header=FALSE,sep="t")
#读入转录因子ID与名字对应的文件
term2name <- read.csv("~/Desktop/scripts/TF_analysis/TF_name.txt",header=FALSE,sep="t")
#进行富集分析
x <- enricher(gene,TERM2GENE=term2gene,TERM2NAME=term2name)
#富集分析结果保存到文件
out_file <- paste("DEG_NS1vsCT_HC_TF_enricher.out.txt",sep ="t")
write.csv(x,out_file)
#图片展示
dotplot(x, showCategory=10) 
#保存图片
ggsave(filename="DEG_NS1vsCT_HC_TF_enricher_dotplot.png",dpi=600)
dev.off()

结果展示

结果部分其实还有很多形式展示,具体的请见Y叔的R包clusterProfiler的说明。Y叔今年一月份在bioRxiv上在线一篇文章可以参考”clusterProfiler: An universal enrichment tool for functional and comparative study”。

Y叔文中展示的图片

其实基因家族也是可以做富集分析的。只要知道哪些基因属于哪个基因家族就可以了。但是目前,我还没找到相关的文件。唯一想到的是可以根据PFAM ID做,也即蛋白结构域的ID。

转载本文请联系原作者获取授权,同时请注明本文来自马省伟科学网博客。
链接地址:
http://blog.sciencenet.cn/blog-1094241-1146114.html

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骨髓间充质干细胞经验总结- 实验基础- 百通生物—干细胞培养专题—丁香园会议频道

骨髓间充质干细胞经验总结

转载请注明来自丁香园
发布日期:2012-06-16 13:01 文章来源:丁香园

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2003年8月,为给大家提供一个网上交流干细胞研究经验的平台,我们干细胞版设立了骨髓间充质干细胞培养讨论区,经过近三个月的讨论学习,我们既学习丰富了自己的知识体系,也对间充质干细胞尤其是分离培养方面有了更为翔实的认识,为了大家阅读的方便,我们决定把本版中的相关内容,同时参考部分书目和文献,做一总结。

一、骨髓间充质干细胞的分离

目前常用的分离MSC的方法有全骨髓法和密度梯度离心法,全骨髓法即根据干细胞贴壁特性,定期换液除去不贴壁细胞,从而达到纯化MSC的目的。密度梯度离心法即根据骨髓中细胞成分比重的不同,提取单核细胞进行贴壁培养。随着对MSC表面抗原认识的深入,有人利用免疫方法如流式细胞仪法、免疫磁珠法等对其进行分离纯化,但经过流式或磁珠分选后的细胞出现了增殖缓慢等一些问题,加之耗费较大和技术的难度,在某种程度上限制了这些方法的广泛应用。

1.    直接培养法(全骨髓培养法)

1987年,Friedenstein等发现在塑料培养皿中培养的贴壁的骨髓单个核细胞在一定条件下可分化为成骨细胞、成软骨细胞、脂肪细胞和成肌细胞,而且这些细胞扩增20-30代后仍能保持其多向分化潜能,这类细胞即为骨髓间充质干细胞(BMSC),其工作对今后MSC的研究具有重要意义,不仅证实了骨髓MSC的存在,而且创建了一种体外分离和培养MSC的简便可行的方法,得到了广泛的应用。

culture-spirit采用直接贴壁法,24-36小时首次换液,换液时用PBS洗两次,7-10天传第一代,以后2-3天传代。培养基采用Hyclone的DMEM/F-12(1:1),血清是天津TBD的FBS(顶级),得到了较好的培养结果。

布兰卡根据自己培养大鼠MSC的经验,详细介绍了实验步骤:

(1)接种后60-80分钟,换液去除悬浮细胞

(2)原代培养24h,48h各换液一次

(3)观察细胞情况,在原代培养7天左右时,如观察到成片的典型形态的细胞,在瓶底用Marker笔标记,0.25%胰酶消化,镜下观察控制,约5-10分钟(室温太低时应放置到孵箱中),加入全培养基终止消化,瓶体朝上,吸管轻轻吹打4-8分钟,尤其是标记部位。不要用力吹打,以免把贴壁较牢的成纤维细胞,上皮样细胞吹打下来

(4)传代到新瓶中,加入少量培养基,孵箱静置20-30分钟后,MSC大多牢固贴壁。瓶底朝上,轻轻吹打,丢弃悬浮以及贴壁不牢的细胞(大多是上皮样细胞),加入全培养基开始传代培养,如观察仍有较多杂细胞,可重复上述步骤。

(5)经上述处理后,原代的那瓶细胞仍有一些MSC生长,可继续按原代培养,如观察到MSC的克隆,仍可按上述步骤纯化处理。

(6)原代或传代的细胞如观察的少量成片的杂细胞,可直接镜下瓶底标记后,超净台里用长吸管尖端机械刮除,吸出去掉。

菊花与刀用的是全骨髓培养法,直接用含10%的FBS培养基冲洗大鼠的股骨和胫骨,为了避免冲起许多气泡应缓慢冲,冲的次数不应太多。冲洗后不用离心直接接种在培养瓶里,48h~72h后首次换液,一般7~10天可传代。

天之饺子介绍的小鼠MSC的分离方法:取6w小鼠的股骨和胫骨,直接用含培养基冲出骨髓,一定要尽量把干垢端的骨髓冲干净。冲洗后不离心直接接种在培养瓶里,24-48h后去悬浮,再接下来的每3-4天换液一次,直到需要传代。

2.  密度梯度离心法

裴雪涛等用比重为1.073g/ml的percoll分离(400g×20min)人骨髓MSCs,取界面处细胞层,离心后洗涤以2×105/cm2的密度接种,72h后更换培养液,弃掉未贴壁细胞,以后每3d换液一次。细胞长到80%汇合时1:1传代。

菊花与刀利用PERCOLL密度1.073分离大鼠MSC 时,用2400rpm×20mins后可见中间有一层约1~2mm厚的白色层,仔细用吸管吸取这一层再用PBS离心2遍即可加培养基和胎牛血清培养即rMSCs,。

周进明等利用密度为1.082的percoll分离小鼠MSCs,500g×30min离心后,取中间的单个核细胞层,PBS洗两次,接种于IMDM培养基,1d后换液,去掉非贴壁细胞,以后每3-4天换液。

jetter用过FICOLL,FERCOLL,上海二分厂的淋巴细胞分离液分离MSC细胞效果都不错,当然所获细胞群的纯度不一,Percoll最纯,而上海二分厂的淋巴细胞分离液所获细胞群的传代能力优秀(35 PASSAGE)。

本版的部分园友认为MSC贴壁培养得到的细胞不均一,但是多能分化能力和增殖力好,percoll分离得到的细胞较为均一,多能分化性和增殖力不如贴壁培养的,尤其是增殖力相差很远,有人添加bFGF或/和表皮生长因子发现可以增强增殖能力。

二、 骨髓间充质干细胞的培养

天之饺子认为,间质干细胞的培养一定要用塑料培养瓶,不能用玻璃的。因为象间质干这类的基质细胞不易贴玻璃,而且现在买的进口好品牌的培养瓶都涂有一层促细胞贴壁的物质,多数园友培养时都添加10-15%胎牛血清。

分离培养结果的差异可能是由于各个研究小组标本来源、采用的分离方法不同从而所获得的细胞不同,或者用来检测的细胞代数不同,或者培养过程中用的胎牛血清不同,导致MSCs获得或失去这些表面标记物的表达。

三、 骨髓间充质干细胞的特性

体外培养的MSC体积小,成梭形,核浆比大。不表达分化相关的细胞标志,如I、II、III型胶原、碱性磷酸酶或Osteopontin;也不表达SH2、SH3、CD29、CD44、CD71、CD90、CD106、CD120a、CD124、CD166和多种表面蛋白,这群细胞特性稳定,扩增一代和两代后的细胞同质性分别达到95%和98%。MSC联系传代培养和冷冻保存后仍能具有多向分化潜能,而且保持正常的核型核端粒酶活性,但不易自发分化,在体外特定的诱导条件下,MSC可以分化为骨、软骨、脂肪、肌腱、肌肉、神经等多种细胞。

四、其他相关内容

Jiang将从成人以及成年大鼠和小鼠骨髓分离的间充质干细胞(CD45-TER119-)命名为多潜能成年祖细胞,他们证明,MAPC高表达端粒酶,而且随着细胞的扩增,端粒的长度不变,单个MAPC来源的细胞群不仅能在体外向3个胚层的细胞分化,而且能在体内能够向各种组织细胞分化,相比较而言,形态与MSC相似的体外培养的皮肤成纤维细胞则不具有类似的分化潜能。

参考文献

生理学报2003.55(2):153-159

人骨髓间充质干细胞在成年大鼠脑内的迁移及分化

中华放射医学与防护杂志.2002,22(3).-167-169

培养小鼠骨髓间充质干细胞及其移植后在体内的定位分布

Exp Biol Med Vol. 226(6):507-520, 2001

Mesenchymal Stem Cells

NATURE |VOL 418 | 4 JULY 2002

Pluripotency of mesenchymal stem cells derived from adult marrow

编辑: gaowei2010

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使用STEM程序分析基因表达的时间趋势并划分聚类群

使用STEM程序分析基因表达的时间趋势并划分聚类群

编者荐语:

最近可能会用到,学习一下

以下文章来源于小白鱼的生统笔记
,作者生信小白鱼 鲤小白

使用STEM程序分析基因表达的时间趋势并划分聚类群

前两篇分别介绍了使用Mfuzz包TCseq包在具有时间序列特点的转录组、蛋白质组数据中分析基因或蛋白表达的时间趋势,并将具有相似表达模式的基因或蛋白划分聚类。这两种方法都是R语言程序包。但如果您不习惯用R,但仍期望实现类似的功能(时间趋势分析、聚类以及可视化作图等),本篇再继续介绍一个图形界面程序,短时间序列表达挖掘器(Short Time-series Expression Miner,STEM),它在很多文献中也常见到。

STEM是一个Java程序,可用于聚类、比较和可视化来自短时间序列(一般在8个时间点以内)的基因表达数据,识别重要的时间表达谱以及与这些谱相关的基因。同时,STEM还可以对具有相同时间表达模式的基因集执行功能富集分析,例如Gene Ontology(GO)富集。事实上,只要是带有“梯度”的数据,理论上都可以使用STEM进行分析,而非仅局限于时间序列,如剂量响应试验等,按“梯度”顺序排列好样本后也可以作为STEM的输入。

接下来简单展示STEM的使用。

安装STEM程序

STEM官网:http://www.cs.cmu.edu/~jernst/stem/

运行STEM需要Java环境支持,需要首先确保您电脑中已经安装了Java。如果尚未安装,可在STEM官网的主界面点击对应的链接下载安装Java。

之后,在STEM官网中点击对应的链接下载STEM程序包。下载下来是一个压缩包形式,解压后点击其中的“stem.jar”即可执行STEM主程序。

使用STEM分析基因表达的时间趋势并划分聚类群的简单演示

1、数据准备

首先您需要准备带有“梯度”的数据,这里以一个基因表达值的时序数据为例,第一列是基因名称,随后几列是各基因在各时间样本中的表达值信息,时间样本按时间顺序依次排列。

2、数据加载和STEM参数设置

在STEM主界面中加载数据,设置合适的参数后,运行分析。

界面的第一部分“1. Expression Data info”中,点击“Browse”加载数据。点击“View Data File”可查看已加载的数据,如果您有生物学重复,可再通过“Repeat Data”指定加载。随后,可选指定一种数据标准化方式。

界面的第二部分“2. Gene info”用于指定加载基因注释信息文件,以便在后续获得聚类后,对目标聚类群内的基因集执行富集分析,如GO、KEGG功能分析等。这里先忽略此功能,我们先将此处留空,下文会再提到这一点。

界面的第三部分“3. Option”用于设置聚类选项,如聚类方法选择(STEM聚类、或者K-means聚类)以及聚类参数等(具体细节随方法而不同)。在“Advanced Options”中可修改更多高级参数,如过滤基因选项、与评估聚类重要性有关的选项、与基因注释有关的选项等。

设置完毕后,点击第四部分的“Execute”执行分析。

3、时间趋势分析和聚类结果

STEM自动弹出分析结果,显示了基因表达的时间动力学聚类的概况。每个折线图代表一个聚类群,相似时间动力学模式的基因被划分到同一聚类群中,折线图趋势代表了该聚类群中基因随时间表达的整体走向。对于具有统计意义(显著时间特征)的聚类群,以彩色背景突出。每个折线图左上方数字是该聚类群的名称,点击特定的折线图将显示该聚类群的统计显著性p值、所包含基因的数量以及每个基因随时间表达的趋势折线图。

在界面中点击“Main Gene Table”,即可将所有基因划分的聚类群名称连同它们的表达值信息一并输出。

若期望同时对各聚类群的基因执行功能富集分析

如果您恰好分析的是基因表达谱数据,STEM也基于超几何分布的原理提供了对目标基因集执行富集分析的方法,但是基因功能注释(如GO、KEGG等)信息需要手动添加。

1、数据准备

除了准备基因表达值矩阵外,还需要提供基因的功能注释分类信息,例如这里添加了基因的GO功能注释表。基因注释表无需表头,共两列,第一列是基因名称,第二列是基因功能注释。基因注释表原则上应包含背景基因在内。

2、数据加载和STEM参数设置

程序界面中,“1. Expression Data info”和“3. Option”的数据加载、标准化以及聚类参数选择等,和上述操作过程一致,不再多说。

但此时需要在“2. Gene info”中指定加载基因注释信息文件,以便在后续获得聚类后,对目标聚类群内的基因集执行富集分析。

设置完毕后,点击“Execute”执行分析。

3、时间趋势分析和聚类结果

类似地,对于聚类结果的描述可参考上文。

不过此时,将在各聚类群中增添了基因的功能富集分析结果,此处是以GO富集为例的展示。在结果界面点击“Profile GO table”即可查看GO富集分析的统计详情,以及输出至本地。

其它功能

以上仅对STEM执行时序数据的聚类以及基因功能富集分析的方法做了简单演示。更多的功能由于使用不多,这里不再提及。例如在上文STEM的主程序界面中,在“2. Gene info”中也提供了基因位置信息的录入窗口,可据此绘制目标基因在染色体中的分布图(如下样式,来自STEM操作手册的示例图)。如果您对更多功能感兴趣,可自行学习STEM操作手册(http://www.cs.cmu.edu/~jernst/stem/STEMmanual.pdf)。

友情链接

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MeSH加Cytoscape你也可以绘制超高颜值富集图

MeSH加Cytoscape你也可以绘制超高颜值富集图

原创

生信技能树



生信技能树


3月19日

收录于话题
#​cytoscape的十大插件

12个

最近实验室同学在组会上分享了一篇很有意思的文章,是于  January 2021,  发表在CELL杂志的文章《Spliceosome-targeted therapies trigger an antiviral immune response in triple-negative breast cancer》,链接是:https://doi.org/10.1016/j.cell.2020.12.031

里面的GO/KEGG等生物学数据库富集注释被替换成为了 MeSH terms 的富集,而且结果还很酷炫,如下所示:

酷炫的富集分析

我看了看,文章里面的关于这个图的图例写的是:B) MeSH term enrichment analysis of top 50 resistance candidates. Enriched MeSH terms (FDR <0.1) grouped by related function. Node size represents number of shRNAs that significantly conferred resistance (R4 significant shRNAs highlighted in yellow).

也就是说,每一个基因都有一个值,就是它被多少个shRNAs所靶向,这个文章使用的是forward genetic screen with a short hairpin RNA (shRNA) library (18,370 shRNAs targeting 1,837 genes) ,它根据基因的shRNAs靶向情况把基因排序后,选取top50个基因,进行功能注释。

50个基因在附件

如下所示:

50个基因在附件

那么MeSH是何方神圣呢,我在公众号《 Y叔叔  YuLabSMU  2018-11-01》看到了这个:文章发表:Using meshes for MeSH term enrichment and semantic analyses,提示我们MeSH是个体量比GO还大的生物医学注释库,嘱咐总盯着GO看,有好多很好的注释库,都没什么人在用,比如MeSH就可以给大家提供不同的角度,挖掘不同的信息,不防试试。

步骤如下:

  • Analysis of over-represented Medical Subject Headings (MeSH) was performed using the R package ‘‘meshes’’ (v1.8.0) (Yu, 2018) with the following parameters: MeSHDb = ‘MeSH.Hsa.eg.db’, database = ‘gene2pubmed’ and category = ‘C’.
  • For Cytoscape visualization, individual genes in MeSH term categories were set as nodes and common MeSH terms as edges.

也就是说,首先你得下载和安装meshes这个包,然后使用里面的函数进行MeSH terms 的富集。

作者的MeSH富集结果也在附件

Table S2. Resistance Candidate MeSH Enrichment, Related to Figure 2

MeSH富集结果也在附件

我这里就不给出来代码了,作为一个学徒作业,反正这50个基因大家可以去文章附件复制粘贴拿到,然后R包meshes呢自己摸索一下,做一个富集。我还没有来得及看这个包,不过我猜想应该是跟Y叔的其它包其它函数用法类似,大家都是成熟的生信工程师了,该学会自己看文档了!加油!

如果是普通的富集分析

就可以使用下面的代码,当然了,也是有不同的数据库可以选择:

# 自己想办法读取 文章附件的50个基因,并且针对symbol转为ENTREZID
library(ggplot2)
library(clusterProfiler)
library(org.Hs.eg.db)
# top50基因
df <- bitr(unique(top50), fromType = "SYMBOL",
           toType = c( "ENTREZID" ,'GENENAME'),
           OrgDb = org.Hs.eg.db)
head(df)  
# 存储为 df 这个对象 
gene_up=df$ENTREZID
enrichKK <- enrichKEGG(gene         =  gene_up,
                       organism     = 'hsa',
                       #universe     = gene_all,
                       pvalueCutoff = 0.1,
                       qvalueCutoff =0.1)
head(enrichKK)[,1:6] 
dotplot(enrichKK)
enrichKK=DOSE::setReadable(enrichKK, OrgDb='org.Hs.eg.db',keyType='ENTREZID')
enrichKK 

比如文章的下图,就选择了 Reactome  这个数据库:

Reactome数据库注释结果

(A) Immune signaling pathway components are enriched among genes that confer resistance to spliceosome inhibition. StringDB functional enrichment analysis was performed on the top 50 SD6 resistance candidates identified by the shRNA screen. Functionally enriched Reactome Pathways with FDR < 0.001 are shown.

但是图例里面又出来了 StringDB  这个新花样!

还有一个Cytoscape的可视化

其中主要是 Table S2. Resistance Candidate MeSH Enrichment  里面的结果的解析,本身呢,Y叔的包也是提供类似的网路可视化,就是一般人想通过代码来提高颜值确实是困难,那么成熟的工具比如Cytoscape就是一个很好的选择:

至少我一般都是看了看官方文档而已:

#(3)可视化
#条带图
par(mfrow=c(2,1))
barplot(enrichKK,showCategory=20)
#气泡图
dotplot(enrichKK)
#下面的图需要映射颜色,设置和示例数据一样的geneList
# geneList = deg$logFC
# names(geneList)=deg$ENTREZID
# geneList = sort(geneList,decreasing = T)
#(3)展示top5通路的共同基因,要放大看。
#Gene-Concept Network  
cnetplot(enrichKK)

做出来的图一般来说颜值都不咋地,不过仍然是强推Y叔clusterProfiler的一些可视化方法,函数列表:

  • barplot
  • cnetplot
  • dotplot
  • emapplot
  • gseaplot
  • goplot
  • upsetplot

好几个都是以前没有介绍过的,有趣的是我准备浏览这些可视化函数的帮助文档的时候,看到了这样的话:

重点来了,Y叔特意为其包写了一本书来介绍其用法。Please go to https://yulab-smu.github.io/clusterProfiler-book/ for the full vignette.

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最近实验室同学在组会上分享了一篇很有意思的文章,是于  January 2021,  发表在CELL杂志的文章《Spliceosome-targeted therapies trigger an antiviral immune response in triple-negative breast cancer》,链接是:https://doi.org/10.1016/j.cell.2020.12.031

里面的GO/KEGG等生物学数据库富集注释被替换成为了 MeSH terms 的富集,而且结果还很酷炫,如下所示:

酷炫的富集分析

我看了看,文章里面的关于这个图的图例写的是:B) MeSH term enrichment analysis of top 50 resistance candidates. Enriched MeSH terms (FDR <0.1) grouped by related function. Node size represents number of shRNAs that significantly conferred resistance (R4 significant shRNAs highlighted in yellow).

也就是说,每一个基因都有一个值,就是它被多少个shRNAs所靶向,这个文章使用的是forward genetic screen with a short hairpin RNA (shRNA) library (18,370 shRNAs targeting 1,837 genes) ,它根据基因的shRNAs靶向情况把基因排序后,选取top50个基因,进行功能注释。

50个基因在附件

如下所示:

50个基因在附件

那么MeSH是何方神圣呢,我在公众号《 Y叔叔  YuLabSMU  2018-11-01》看到了这个:文章发表:Using meshes for MeSH term enrichment and semantic analyses,提示我们MeSH是个体量比GO还大的生物医学注释库,嘱咐总盯着GO看,有好多很好的注释库,都没什么人在用,比如MeSH就可以给大家提供不同的角度,挖掘不同的信息,不防试试。

步骤如下:

  • Analysis of over-represented Medical Subject Headings (MeSH) was performed using the R package ‘‘meshes’’ (v1.8.0) (Yu, 2018) with the following parameters: MeSHDb = ‘MeSH.Hsa.eg.db’, database = ‘gene2pubmed’ and category = ‘C’.
  • For Cytoscape visualization, individual genes in MeSH term categories were set as nodes and common MeSH terms as edges.

也就是说,首先你得下载和安装meshes这个包,然后使用里面的函数进行MeSH terms 的富集。

作者的MeSH富集结果也在附件

Table S2. Resistance Candidate MeSH Enrichment, Related to Figure 2

MeSH富集结果也在附件

我这里就不给出来代码了,作为一个学徒作业,反正这50个基因大家可以去文章附件复制粘贴拿到,然后R包meshes呢自己摸索一下,做一个富集。我还没有来得及看这个包,不过我猜想应该是跟Y叔的其它包其它函数用法类似,大家都是成熟的生信工程师了,该学会自己看文档了!加油!

如果是普通的富集分析

就可以使用下面的代码,当然了,也是有不同的数据库可以选择:

# 自己想办法读取 文章附件的50个基因,并且针对symbol转为ENTREZID
library(ggplot2)
library(clusterProfiler)
library(org.Hs.eg.db)
# top50基因
df <- bitr(unique(top50), fromType = "SYMBOL",
           toType = c( "ENTREZID" ,'GENENAME'),
           OrgDb = org.Hs.eg.db)
head(df)  
# 存储为 df 这个对象 
gene_up=df$ENTREZID
enrichKK <- enrichKEGG(gene         =  gene_up,
                       organism     = 'hsa',
                       #universe     = gene_all,
                       pvalueCutoff = 0.1,
                       qvalueCutoff =0.1)
head(enrichKK)[,1:6] 
dotplot(enrichKK)
enrichKK=DOSE::setReadable(enrichKK, OrgDb='org.Hs.eg.db',keyType='ENTREZID')
enrichKK 

比如文章的下图,就选择了 Reactome  这个数据库:

Reactome数据库注释结果

(A) Immune signaling pathway components are enriched among genes that confer resistance to spliceosome inhibition. StringDB functional enrichment analysis was performed on the top 50 SD6 resistance candidates identified by the shRNA screen. Functionally enriched Reactome Pathways with FDR < 0.001 are shown.

但是图例里面又出来了 StringDB  这个新花样!

还有一个Cytoscape的可视化

其中主要是 Table S2. Resistance Candidate MeSH Enrichment  里面的结果的解析,本身呢,Y叔的包也是提供类似的网路可视化,就是一般人想通过代码来提高颜值确实是困难,那么成熟的工具比如Cytoscape就是一个很好的选择:

至少我一般都是看了看官方文档而已:

#(3)可视化
#条带图
par(mfrow=c(2,1))
barplot(enrichKK,showCategory=20)
#气泡图
dotplot(enrichKK)
#下面的图需要映射颜色,设置和示例数据一样的geneList
# geneList = deg$logFC
# names(geneList)=deg$ENTREZID
# geneList = sort(geneList,decreasing = T)
#(3)展示top5通路的共同基因,要放大看。
#Gene-Concept Network  
cnetplot(enrichKK)

做出来的图一般来说颜值都不咋地,不过仍然是强推Y叔clusterProfiler的一些可视化方法,函数列表:

  • barplot
  • cnetplot
  • dotplot
  • emapplot
  • gseaplot
  • goplot
  • upsetplot

好几个都是以前没有介绍过的,有趣的是我准备浏览这些可视化函数的帮助文档的时候,看到了这样的话:

重点来了,Y叔特意为其包写了一本书来介绍其用法。Please go to https://yulab-smu.github.io/clusterProfiler-book/ for the full vignette.

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美学贴面视频一例。备牙还是不备牙???-徐永钰的博客-KQ88口腔博客

美学贴面视频一例。备牙还是不备牙???

2018-11-04 15:40 阅读:2000

案例简述

     本病例的 12    13   22   23  是腭倾位的牙 ,11   21  稍稍有点前突,咬合是重度深覆盖,所以不需要考虑咬合的问题。固备牙量不用太多,正好通过贴面的厚度来补偿了 11 12   21   22之间的突度落差。患者反而觉得牙齿唇侧维度变圆润了,牙齿看上去更齐了。

     不备牙贴面适应症毕竟是少的,可以少备,但是一点不备肯定不现实,备成自切端依次向颈部逐渐变薄的样子颈部微微有大约0.2左右的肩台,就目前的材料而言其实颈部是可以最薄做到0.2毫米的。然后粘接后通过抛光这个厚度就能实现无限薄。这也是好多病例可以做的非常小,非常薄的原因。

   我们每天都在快乐的进步着,希望本视频可以带给大家一定的思路,有不足之处还望不吝赐教,谢谢

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