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利用cas9+sgRNA表达质粒载体快速进行细胞的某基因knockout单克隆筛选

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如果流式筛选GFP阳性细胞内的敲除率那么高(16/18),单克隆扩增后是否可以直接裂解提蛋白,做WB验证呢?我不想知道编辑的碱基数和位置,只想知道蛋白敲除后细胞表型的变化?

查资料后发现“单纯用wb验证可能存在问题,因为cas9/sgRNA进行基因编辑时,可能通过切除非3倍数的碱基,造成移码突变,翻译出突变的蛋白,而抗体的原理是识别蛋白的某个序列或者某个空间构象。这样就算成功进行了基因编辑,WB时还可能造成抗体能够识别突变后的蛋白的情况,造成WT和KO的细胞系WB条带结果时无明显变化。” 而且抗体还存在非特性识别其他抗原的情况,你看到的蛋白并非你研究的目的蛋白。

201809091738389166.pdf

现在快速建立单克隆的方法是gRNA+cas9蛋白电转,然后挑单克隆96孔板,相比大皿转慢病毒,puro筛选,稀释96孔板的优势是什么?转染效率高?cas9蛋白不整合,不会有后面的潜在的影响,比如cas9整合位点截断了某个基因,稀释到96孔板后可以直接看gfp,单克隆加gfp就能确定是转染成功,然后挑30个克隆,能拿到一两个成功编辑的克隆?

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