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2.插入片段PCR扩增
插入片段扩增可用任意PCR酶扩增，无需考虑产物末端有无A尾 (重组过程中将被去除，在最终载体中不会出现)。但为了减少扩增突变的引入，建议使用高保真聚合酶进行扩增（Hieff Canace® High-Fidelity DNA Polymerase，Cat No. 10135ES）。
[……]
2022年9月29日
发表者 kimi1006
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2022年9月18日
发表者 kimi1006
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CRISPR操作指南-载体构建和细胞建系教程 – 科维创 病毒包装
CRISPR操作指南-载体构建和细胞建系教程
设计完sgRNA之后，就可以选择性克隆到此目的载体了。在这里我们选择lentiCRISPR v2载体作为例子说明。lentiCRISPRv2是张锋实验室发布一个慢病毒载体系统，cas9和sgRNA表达框在同一载体上。而且Cas9的C端带有FLAG融合标签，载体包含Puromycin抗性基因，适合建稳转系（图21）。验证sgRNA活性的时候也适合顺转；包装成慢病毒适合常规细胞系的建系。构建非常方便。该载体具体特征如下：
克隆gDNA使用BsmBI位点，载体可以切出一个~1.9 kb的filler片段，便于确认酶切成功并利于载体回收（图2[……]
2022年9月18日
发表者 kimi1006
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双靶点CRISPR载体构建 (哺乳动物细胞) – 知乎
双靶点CRISPR载体构建 (哺乳动物细胞)
为了基因更好的表达
1. CRISPR/Cas9核酸酶切靶序列原理图
2 相关载体图谱
2.1 中间载体 ，sgRNA载体（预设有BbsI酶切位点）
中间载体↑
2.2 CRISPR/Cas9骨架载体，表达CAS9，同时有完整的sgRNA表达框
含有CAS9的骨架载体（骨架载体可以换成PX459、PX461，PX462、lenticrispr V2、lentiguide-puro或者其他同种gRNA scaffold的质粒）
3. 基因组靶位点选择和双链接头设计
3.1 靶位点选择
根据目的基因的物种在sgRNA设计网站上是设计靶点序列，根据需要选择特异性好[……]
2022年9月18日
发表者 kimi1006
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一步法构建dual gRNA质粒
2022年9月18日
发表者 kimi1006
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Addgene: Protocol – pLKO.1 – TRC Cloning Vector
pLKO.1 – TRC Cloning Vector
Addgene Plasmid 10878. Protocol Version 1.0. December 2006.
Copyright Addgene 2006, All Rights Reserved. This protocol is provided for your convenience. See “warranty information” in appendix.
Table of Contents
2022年9月18日
发表者 kimi1006
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CRISPR-Cas9 sgRNA设计和载体构建 – 王进的个人网站
CRISPR-Cas9 sgRNA设计和载体构建 – 王进的个人网站
CRISPR-Cas9系统是目前最流行的基因组编辑技术，可以实现目的基因的敲除、插入和突变，该技术是一种由RNA指导Cas蛋白对靶基因定性修饰技术。科学家为了让Cas蛋白定向剪切DNA序列，在CRISPR工作机理的基础上，人为重组了一段目的基因的sgRNA（small-guide RNA），在sgRNA的引导下，Cas9蛋白可以实现对目的基因的定向切割。本文主要介绍，目的基因sgRNA设计和如何将sgRNA构建到CRISPR-Ca[……]
2022年9月18日
发表者 kimi1006
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lentiCRISPRv2 构建的经验汇总
lentiCRISPRv2 构建的经验汇总
2017-12-15 07:00
2022年9月17日
发表者 kimi1006
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PCR方法实验步骤和常见问题
PCR方法实验步骤和常见问题
简介
聚合酶链式反应，简称PCR，是一种将几个或几十个拷贝数DNA片段扩增至上百万份拷贝的方法，这是迄今为止最为重要的技术之一。PCR技术的影响不仅仅局限于生物科学领域，几乎人人都可以感受到PCR所带来的改变，在亲子鉴定以及犯罪调查中PCR技术便有广泛应用。而人类基因组计划，这一具有划时代意义的测序工程，如果缺少了PCR技术手段则根本无法开始。
而PCR技术的发明同样有着一个传奇的故事。PCR技术的发明者Kary Banks Mullis讲述过他是如何捕捉到PCR的灵感的：1983年春天的一个晚上，他开着车行驶于加利福尼亚的群山公路之中，那蜿蜒的公路让他瞬间想到了[……]
2022年9月17日
发表者 kimi1006
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分子克隆经验
2022年9月2日
发表者 kimi1006
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CRISPR-Cas9 sgRNA设计和载体构建 – 王进的个人网站
CRISPR-Cas9 sgRNA设计和载体构建 – 王进的个人网站
CRISPR-Cas9系统是目前最流行的基因组编辑技术，可以实现目的基因的敲除、插入和突变，该技术是一种由RNA指导Cas蛋白对靶基因定性修饰技术。科学家为了让Cas蛋白定向剪切DNA序列，在CRISPR工作机理的基础上，人为重组了一段目的基因的sgRNA（small-guide RNA），在sgRNA的引导下，Cas9蛋白可以实现对目的基因的定向切割。本文主要介绍，目的基因sgRNA设计和如何将sgRNA构建到CRISPR-Ca[……]