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2022年9月29日
发表者 kimi1006
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多片段一步法快速克隆试剂盒 快速克隆试剂盒|Plus Multi One Step Cloning Kit

  • 2.插入片段PCR扩增

    插入片段扩增可用任意PCR酶扩增,无需考虑产物末端有无A尾 (重组过程中将被去除,在最终载体中不会出现)。但为了减少扩增突变的引入,建议使用高保真聚合酶进行扩增(Hieff Canace® High-Fidelity DNA Polymerase,Cat No. 10135ES)。

[……]

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2022年9月18日
发表者 kimi1006
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CRISPR操作指南-载体构建和细胞建系教程 – 科维创 病毒包装

CRISPR操作指南-载体构建和细胞建系教程

设计完sgRNA之后,就可以选择性克隆到此目的载体了。在这里我们选择lentiCRISPR v2载体作为例子说明。lentiCRISPRv2是张锋实验室发布一个慢病毒载体系统,cas9和sgRNA表达框在同一载体上。而且Cas9的C端带有FLAG融合标签,载体包含Puromycin抗性基因,适合建稳转系(图21)。验证sgRNA活性的时候也适合顺转;包装成慢病毒适合常规细胞系的建系。构建非常方便。该载体具体特征如下:

  克隆gDNA使用BsmBI位点,载体可以切出一个~1.9 kb的filler片段,便于确认酶切成功并利于载体回收(图2[……]

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2022年9月18日
发表者 kimi1006
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双靶点CRISPR载体构建 (哺乳动物细胞) – 知乎

双靶点CRISPR载体构建 (哺乳动物细胞)

为了基因更好的表达

1. CRISPR/Cas9核酸酶切靶序列原理图

2 相关载体图谱

2.1 中间载体 ,sgRNA载体(预设有BbsI酶切位点)

中间载体↑

2.2 CRISPR/Cas9骨架载体,表达CAS9,同时有完整的sgRNA表达框

含有CAS9的骨架载体(骨架载体可以换成PX459、PX461,PX462、lenticrispr V2、lentiguide-puro或者其他同种gRNA scaffold的质粒)

3. 基因组靶位点选择和双链接头设计

3.1 靶位点选择

根据目的基因的物种在sgRNA设计网站上是设计靶点序列,根据需要选择特异性好[……]

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2022年9月18日
发表者 kimi1006
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CRISPR-Cas9 sgRNA设计和载体构建 – 王进的个人网站

CRISPR-Cas9 sgRNA设计和载体构建 – 王进的个人网站

2020-05-292022-06-15

CRISPR-Cas9系统是目前最流行的基因组编辑技术,可以实现目的基因的敲除、插入和突变,该技术是一种由RNA指导Cas蛋白对靶基因定性修饰技术。科学家为了让Cas蛋白定向剪切DNA序列,在CRISPR工作机理的基础上,人为重组了一段目的基因的sgRNA(small-guide RNA),在sgRNA的引导下,Cas9蛋白可以实现对目的基因的定向切割。本文主要介绍,目的基因sgRNA设计和如何将sgRNA构建到CRISPR-Ca[……]

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2022年9月17日
发表者 kimi1006
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PCR方法实验步骤和常见问题

PCR方法实验步骤和常见问题

简介

聚合酶链式反应,简称PCR,是一种将几个或几十个拷贝数DNA片段扩增至上百万份拷贝的方法,这是迄今为止最为重要的技术之一。PCR技术的影响不仅仅局限于生物科学领域,几乎人人都可以感受到PCR所带来的改变,在亲子鉴定以及犯罪调查中PCR技术便有广泛应用。而人类基因组计划,这一具有划时代意义的测序工程,如果缺少了PCR技术手段则根本无法开始。

而PCR技术的发明同样有着一个传奇的故事。PCR技术的发明者Kary Banks Mullis讲述过他是如何捕捉到PCR的灵感的:1983年春天的一个晚上,他开着车行驶于加利福尼亚的群山公路之中,那蜿蜒的公路让他瞬间想到了[……]

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2022年9月2日
发表者 kimi1006
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CRISPR-Cas9 sgRNA设计和载体构建 – 王进的个人网站

CRISPR-Cas9 sgRNA设计和载体构建 – 王进的个人网站

2020-05-292022-06-15

CRISPR-Cas9系统是目前最流行的基因组编辑技术,可以实现目的基因的敲除、插入和突变,该技术是一种由RNA指导Cas蛋白对靶基因定性修饰技术。科学家为了让Cas蛋白定向剪切DNA序列,在CRISPR工作机理的基础上,人为重组了一段目的基因的sgRNA(small-guide RNA),在sgRNA的引导下,Cas9蛋白可以实现对目的基因的定向切割。本文主要介绍,目的基因sgRNA设计和如何将sgRNA构建到CRISPR-Ca[……]

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