优质用CRISPR建稳定细胞系的方法之讨论

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freecell楼主

发布于 2016-03-04 22:40

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这个帖子发布于 4 年零 192 天前,其中的信息可能已发生改变或有所发展。

Q: 以前用CRISPR,都是用在原代细胞上,因为转染效率极低,所以,只有用lentivirus来做。

现在我要建立几个KO的stable cell line(不是用原代细胞做)。

首先,不经过仔细思考的办法,就是用LentiCrispr的慢病毒来做,然后加puro筛选。但是,这个方法不好的地方是,Cas9一直表达,时间长了,off target肯定会比较多。后来觉得,用Tet On的promoter来控制Cas9的表达,这样只在短时间内表达,应该会好很多。

后来再一想,这个gene edit,本来就是permanent的。没必要用lentivirus来,这lentivirus还会整合到genome里,顺便破坏哪个基因还不晓得。为什么不直接用transfection呢?唯一可能的问题就是效率可能低了点。还有可能问题的,瞬时transfection,通常每个细胞的plasmid会很多,这样Cas9的量太高了,会不会又会增加off target的概率?

大家一般是首选什么策略?

A1: 也可以用别的不整合的virus

A2: 可以考虑用Cas9的mRNA

A3: gRNA不用lenti不就行了

A4: 干嘛这么麻烦,用CRISPR质粒 (px330系列)transient表达Cas9和gRNA,同时转两个,KO效率还是很高的。

如果要做整合,用lenti表达Cas9, 再转入gRNA就是了。不过lenti-Cas9的titer较低,整合效率不高。

A5: Tet-on promoter does NOT work very well.

A6: [没做过,弱问transient transfection之后怎么分离KO的clone?]

共转带Puro/GFP的质粒,用单个Crispr的1:4甚至更少,然后筛选。

A7: 楼主如果细胞能够进行单细胞筛选,那我强烈推荐用sgRNA+Cas9 protein做RNP complex

这个complex打电转效率很高,很推荐用paired guide可以做deletion,容易探测,不存在质粒系统中像楼主提到的问题,我们用CD34+细胞可以达到90%的target effiency

我们用in vitro transcribed的sgRNA+ Cas9 protein室温incubate 15min 然后加到neon transfection打电转。

Cas9 protein有家公司叫PNA bio有卖, thermo也有类似的product

附件里pdf文件是跟我们类似的protocol

A8: [搭车问一下,Crispr建立可诱导基因敲除细胞株的protocol在哪有?]

inducible目前不好做可以稳转Cas9+ inducible sgRNA,这个是目前我觉得最靠谱的.至于inducible Cas9之前有兄弟说了不一定work,我们的经验是还会有Cas9的leakness.

[A9] [没做过,弱问transient transfection之后怎么分离KO的clone?]

用PURO或者GFP筛选一下下,然后从剩下的里面的里面筛单克隆,效率还挺高的。不过这都是建立在transfection效率还不错的基础上

[A10] [请问你用paired guide时,用的是wt cas9,还是用的Cas9 nickase mutant?]

我们用的是wt cas9

Rapid and highly efficient mammalian cell engineering via Cas9 protein transfection PUBLICATION.pdf (1.9 MB)

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