Cell | 小鼠不同组织的蛋白质相互作用图谱

Cell | 小鼠不同组织的蛋白质相互作用图谱

原创

何诗曼



iProteome


今天

2021年7月22日,不列颠哥伦比亚大学Michael Smith实验室等在Cell杂志上合作发表了题为An atlas of protein-protein interactions across mouse tissues的文章,文章中提出了一种新的定量蛋白质组学方法——将蛋白质相关性分析与哺乳动物的稳定同位素标记技术相结合(PCP-SILAM),绘制出七种小鼠组织的蛋白质相互作用组图谱,揭示了超过125000个独特的相互作用。

撰文 | 何诗曼

Highlights

1. PCP-SILAM方法实现了小鼠体内七种组织的蛋白质相互作用组图谱的生成

2. 生成的小鼠蛋白质相互作用组图谱超过原有规模两倍多

3. 不同组织的蛋白质相互作用重组受到严格监管

4. 与组织特异性疾病密切相关的蛋白质形成组织特异性子网络

Introduction

许多蛋白质的生物学功能依赖于与其他蛋白质的特定物理相互作用,这些相互作用的破坏可能导致疾病。因此,定义给定生物体中功能性蛋白质-蛋白质相互作用(相互作用组)的完整图谱是后基因组时代的长期目标,以期更好地理解蛋白质功能、细胞生理过程以及基因型和表型之间的关系。但是,现有的相互作用组图谱只对出现在特定细胞类型或组织中,或在病理生理相关条件下发生的相互作用提供了有限的见解。特异性的组织或细胞类型环境中的靶向相互作用组图谱揭示了特定人类疾病中蛋白质相互作用的重组,但关于哺乳动物组织间的蛋白质相互作用组的基本问题仍未解决。尽管已经进行了大规模的研究来分析人类组织的转录组、蛋白质组和表观基因组,但在相互作用组水平上的分析却是缺乏的。

在这里,作者将PCP与哺乳动物的稳定同位素标记技术(SILAM)相结合以生成七种小鼠组织的蛋白相互作用组图谱。这项研究不仅提供了哺乳动物组织特异性环境中蛋白质-蛋白质相互作用的全局视图,还提供了一个系统的超过原有规模两倍多的小鼠蛋白质相互作用组图谱,揭示了不同生理环境下蛋白质相互作用的广泛重组。

Results

一、小鼠组织的体内相互作用组定量分析

作者使用PCP-SILAM分析了七种小鼠组织的相互作用组,包括脑、心脏、骨骼肌(腓肠肌)、肺、肾、肝和胸腺(图1A)。从13C6-标记(重)和未标记(轻)小鼠组织中收集了总共55个SEC馏分。然后合并重馏分以生成全局参考混合物,并将其添加到所有770种轻馏分中。然后对每个馏分进行液相色谱-串联质谱(LC-MS/MS)分析。在所有馏分中总共检测到7,225种独特的蛋白质(图1B),包含了许多众所周知的蛋白质复合物,例如prefoldin复合物、COP9信号小体或eIF3复合物(图1C)。

图1 PCP-SILAM法测绘的七种小鼠组织的定量相互作用组图谱

作为对数据质量的初步评估,作者将PCP-SILAM与大规模蛋白质组学、转录组学和核糖体分析数据集进行了比较,以了解它们回收已知蛋白质复合物的能力。与大规模转录组、翻译组或蛋白质组数据集(图1G)相比,SEC馏分的共丰度模式被证明可提供更多信息,ROC曲线下的平均面积(AUC)为0.77,与现有的研究相比显著更高。值得注意的是,PCP-SILAM数据中的平均AUC高于对来自294种不同生物条件的5,288次SILAC蛋白质组学实验的meta分析。这些发现说明了PCP相对于大规模蛋白质组“协同调节”网络的主要优势:即通过SEC柱的分离特异性地将同一蛋白质复合物中的蛋白质对与间接关联的蛋白质对区分开来。在PCP-SILAM和基于细胞系的PCP-SILAC之间未观察到AUC的显着差异(图1H;p=0.58),表明尽管整个组织具有更大的复杂性,但对其进行体内相互作用组的分析并未影响数据质量。

二、小鼠组织相互作用组的高置信度统计推断

为了从PCP-SILAM组织蛋白质组谱中获得相互作用组,作者开发了PrInCE,这是一种用于分析共分馏质谱数据的机器学习管道(图2A)。与以前从共分馏数据和公开可用的基因组数据集共同学习的方法相比,PrInCE回收PPIs(蛋白质-蛋白质相互作用)完全来源于质谱数据中所获得的特征。将PrInCE应用于PCP-SILAM数据,在每个组织中识别出19,804到35,536次相互作用(FDR=5%),总共有125,696次独特的相互作用(图2B)。

图2 小鼠组织相互作用组的推断和验证

为了评估从PCP-SILAM数据推断出的网络的质量,作者将每个小鼠组织相互作用组与五个最近发表的使用AP-MS/Y2H进行的高通量人类相互作用组筛选,以及其他文献报道(literature-curated,LC)的相互作用进行了比较。作者计算了反映每个网络与其他大规模基因组数据集一致性的三个指数。所有三个指数都产生了大致一致的网络质量(图2C-E)。这些发现表明PCP-SILAM网络的质量可与最近系统的人类筛查和由假设驱动的小规模实验所确定的相互作用相媲美。

为了通过实验验证PCP-SILAM在小鼠组织中绘制相互作用图谱的能力,作者首先关注了细胞骨架蛋白talin与包含伴侣蛋白的TCP1复合物亚基之间假定存在的相互作用,这之前在小鼠或人类中均未报道过(图2F)。talin的免疫沉淀证实了在小鼠大脑中与TCP1的相互作用(图2G)。为了确认相互作用的组织特异性,作者还在小鼠肝脏中进行了免疫沉淀,其中talin和TCP1复合曲线显示出有限的相关性,并观察到有限的共纯化,与PCP-SILAM结果相一致(图2F和2G)。类似地,作者检测了一个明显的心脏特异性核糖体中的旁系同源物开关,该开关由组成型的Rpl3被其旁系同源物Rpl3l替换而驱动(图2H)。Rpl3l主要在心脏和骨骼肌中表达,它的突变与心房颤动有关。作者从小鼠不同组织中分离纯化出核糖体,然后进行无标记定量,证实了Rpl3l被纳入心脏特异性核糖体(图2I)。因此,正交生化技术证实了PCP-SILAM揭示不同组织相互作用组动态重排的能力。

三、PCP-SILAM对小鼠相互作用组的无偏性扩展

小鼠是一种常见的模式生物,但人们从未测绘过它的相互作用组图谱。为了将作者的网络与已知的小鼠相互作用组进行比较,作者收集了来自9个相互作用数据库的小规模实验中检测到的82,602个小鼠PPI。令人惊讶的是,在PCP-SILAM检测到的125,696个独特相互作用中,只有4,354(2.1%)个与小规模实验检测到的相互作用重叠(图3A)。作者推断,这种相对较小的重叠可能由两个因素来解释:(1)已知小鼠相互作用组的规模小,以及(2)PCP-SILAM与小规模研究中使用的测定之间存在互补性。

图3 PCP-SILAM对LC的小鼠相互作用组的无偏性扩展

本研究中检测到的其余121,342种独特的相互作用以前没有在小鼠中报道过;因此,作者的蛋白质组规模资源将小鼠相互作用组扩展了约2.5倍(图3B)。为了在功能上表征这些PPI,作者比较了LC和PCP-SILAM相互作用之间的GO术语共同注释模式(图3C)。相对于LC的相互作用,PCP-SILAM检测到的小鼠PPI在代谢、翻译和蛋白质折叠的连接方面富集,缺乏细胞间信号传导和增殖的连接。这些发现与PCP-SILAM优先考虑胞质而非核或细胞外复合物的预期基本一致。

作者接下来研究了PCP-SILAM检测到的PPI是否优先扩展了小鼠整体相互作用组的现有区域,或者倾向于形成不同的子网络。为了提供网络拓扑的全局视图,作者应用马尔可夫聚类将整个小鼠相互作用组(包括LC和PCP-SILAM)分组为696个集群(图3D)。92个集群包含至少一种由PCP-SILAM检测到的PPI,其中有50个(54%)还同时包含LC和高通量的PPIs,42个仅由PCP-SILAM相互作用组成。因此,虽然PCP-SILAM揭示了几个在小鼠中完全未知的蛋白质群落,但许多相互作用也扩展了先前由小规模实验定义的小鼠相互作用组的邻域。

LC的蛋白质相互作用数据集受到质疑,因为它们偏向于一组相对较小的高度研究的蛋白质集。高通量互作组图谱研究提供了一种不受研究者偏见影响而定义蛋白质组结构的方法,而且与文献收集的数据集相比,PCP-SILAM检测到的PPIs分布更为均匀(图3G)。

随后,作者假设在生理环境中绘制体内相互作用组,例如在个体组织中,可以优先揭示新的相互作用。最终发现,PCP-SILAM确定了218种未知功能蛋白质的相互作用伙伴,并且这些相互作用比相互作用组平均水平具有显着更高的组织特异性(图3E)。类似地,作者绘制了涉及366种蛋白质的相互作用,这些蛋白质之前没有检测到相互作用的伙伴(interactome orphans)并发现这些相互作用同样显示出组织特异性显著增强的趋势(图3F)。因此,绘制哺乳动物组织的体内相互作用组可以揭示蛋白质组研究不充分的部分信息。

四、广泛的相互作用组重组限制了组织特异性相互作用组预测的准确性

在缺乏实验性的组织或细胞类型特异性相互作用组的情况下,计算方法已经发展到预测背景特异性的分子相互作用网络。背景特异性相互作用组预测最广泛使用的策略是:如果两个基因都表达,则两个基因的蛋白质产物只能在给定的背景下相互作用。基因或蛋白质表达数据叠加到静态交互组上,提取节点表达高于特定阈值的网络子集以生成背景特异性的交互组(图4A)。另一种策略是构建组织特异性基因共表达网络,这意味着如果不是物理相互作用,则代表着给定组织中的功能关联。然而,这些方法做出的预测在多大程度上捕获了生理相关的相互作用组重组尚不清楚。

图4 相互作用组的重组限制了组织特异性交互组预测的准确性

使用PCP-SILAM小鼠组织相互作用组作为参考,作者研究了这些方法在预测组织特异性相互作用组方面的准确性。作者计算了预测的和PCP-SILAM组织相互作用组之间的重叠,然后将这种重叠与观察到的随机重组的网络进行比较。令人惊讶的是,相对于随机网络(图4B),基于基因表达预测的组织相互作用组对于实验检测到的相互作用仅富集了2到4倍。这种重叠非常显着,但幅度很小。将蛋白质或磷酸化蛋白丰度叠加到静态网络上,而不是基因表达上,并没有显着改善重叠。因此,无论是组织特异性基因或蛋白质表达,还是共表达,都不足以准确预测组织特异性物理PPI。

预测的组织相互作用组的拓扑结构也与实验确定的相互作用组显着不同。在交互组网络中,连接度最高(“枢纽”)的蛋白质进化缓慢且在生理上是不可或缺的。预测的组织相互作用组的中枢蛋白在组织间高度一致,每个组织中65%–70%的中枢蛋白在所有预测网络之间共享(图4C)。然而,作者发现中枢蛋白在体内的一致性要差得多,在所有组织中只有20个中枢蛋白共享(图4C)。更普遍地说,在体内相互作用中,任何特定蛋白质参与的相互作用的数量(其程度)在组织之间的变化要比在预测的网络中大得多(图4D)。类似地,与仅通过基因表达预测的相比,蛋白质显示出与组织中不同伙伴相互作用的趋势要大得多(图4E)。

综上所述,这些分析揭示了小鼠不同组织的相互作用网络的广泛重组,超出了仅从基因表达可见的范围,影响了单个蛋白质的特定相互作用物和生理相互作用组的全局拓扑特性。至关重要的是,一对蛋白质可以在至少一个环境中相互作用的观察结果并不意味着它们在第二个环境中的表达是重现相互作用的充分条件。例如,尽管F-肌动蛋白加帽蛋白(CapZ)和CapZ相互作用蛋白(CapZIP或Rcsd1)在所有七种组织中都表现出强烈的表达,但这种相互作用是特定于心脏和肌肉的(图4G)。仅根据蛋白质表达无法预测这种组织特异性模式。为了更系统地评估预测的相互作用组是否因组织特异性相互作用而缺失,作者分别为每个组织的相互作用网络进行了随机分组,并计算了在1到7个随机组织相互作用组中发现的相互作用总数。与仅基因表达会低估组织间相互作用组变异程度的预期一致,相对于PCP-SILAM相互作用组,预测的相互作用组在大多数组织特异性相互作用中显著缺失(图4F)。

五、哺乳动物组织中相互作用的进化

将一种生物体中检测到的物理相互作用外推到不同生物体中的直系同源蛋白质对,已被广泛用于预测非模式生物的相互作用组,或者是增加人类相互作用组的覆盖范围。检查三个模型生物的LC相互作用和五个最近的人类高通量相互作用组筛选,作者发现组织特异性相互作用不太可能在进化上保守(图5A)。产生组织特异性相互作用的蛋白质对同样以不太相似的速率共同进化(图5B)。并且相对于普遍相互作用,真核基因组中存在和缺失的相关模式较少(图5C)。因此,实验筛选和大规模基因组数据都突出了组织特异性相互作用的进化新颖性。

图5 哺乳动物组织相互作用组的进化

在每个组织中,管家蛋白与其他管家蛋白的相互作用显示出非常显着的富集(图5D)。相比之下,作者观察到与随机网络相比,组织特异性蛋白和管家蛋白之间相互作用的系统性损耗,特别是在所有七个组织中汇总结果时(图5E)。因此,实验性组织相互作用组图谱表明,进化上新颖的组织特异性相互作用在很大程度上独立于通用相互作用的核心模块来完成组织特异性功能。

总之,这些分析对比了两个系统:存在于所有小鼠组织中的核心细胞模块,以及在单个组织内执行特定功能的辅助模块。前者涉及在很长的进化时间范围内共同进化的古老蛋白质,其相互作用伙伴在物种和组织中得以保存。相比之下,组织特异性相互作用在其他物种中不太保守,并且不成比例地涉及较年轻的蛋白质。值得注意的是,作者观察到这两个系统之间的串扰受到抑制,组织特异性和通用蛋白质之间的相互作用显着减少。

六、组织特异性相互作用重组的严格调控

已经确定进化上古老的蛋白质在组织中具有比相互作用组平均值明显更稳定的相互作用伙伴,本研究试图进一步描述蛋白质的特性,这些蛋白质的相互作用以组织特异性的方式不成比例地重组。为了量化每种蛋白质组织间重组的相互作用程度,作者使用Jaccard指数比较了所有组织对中其相互作用伙伴的相似性(图6A)。

图6 对相互作用重组的严格监管

正如预期的那样,已知蛋白质复合物的成员具有较高的Jaccard指数,在组织中的重新连接显着减少(图6B)。然而,GO富集分析未能识别重新连接的蛋白质中过度表达的功能类别。因此,作者又研究了蛋白质结构特征是否可以预测重组。事实发现,无序蛋白质比它们的结构对应物具有明显更多的重新连接(图6C)。无序的蛋白质片段通常嵌入可以被球状结构域结合的短肽相互作用基序,并且包含此类线性基序的蛋白质同样被显着更多地重新连接(图6D)。内在无序区域也被认为是蛋白质磷酸化的热点,这增加了通过组织特异性翻译后修饰协调相互作用重组的可能性。与这种可能性相一致,磷酸化蛋白在重新连接的蛋白质中富集(图6E),并且重新连接的蛋白质上的磷酸化位点比通用蛋白质上的磷酸化位点明显更具组织特异性。这些发现表明嵌入固有无序区域的结合基序和翻译后修饰位点促进了哺乳动物组织中蛋白质相互作用伙伴的重新连接。

无序蛋白质经常参与信号通路或介导调节功能。作者发现组织间重新连接PPI更可能涉及蛋白激酶、转录因子和细胞表面蛋白受体,可以促进组织特异性信号传导过程。通过计算中介中心性,作者发现组织特异性相互作用具有比通用相互作用显着更高的中心性(图6F)。因此,分子和网络拓扑观点都强调了组织特异性相互作用在组织特异性途径内传播生物信息中的关键作用。

在细胞内,精确地传递生物信息需要大分子相互作用的精确协调。因此,作者假设相互作用伙伴在生理环境中高度可变的蛋白质将受到严格的调节机制的影响,并探寻特定的细胞策略是否调节重新连接蛋白质的可用性。编码重新连接的蛋白质的mRNA的表达水平较低,半衰期较短,转录速度较慢,而且重新连接的蛋白质本身也较少(图6G),并且这种丰度差异受到翻译速率降低和降解速率增加的控制(图6H和6I),表明多种细胞机制汇聚以严格调节蛋白质丰度,其相互作用的伙伴在组织中重新连接。

鉴于重新连接的蛋白质受到严格调控,作者进一步研究了相互作用伙伴在组织之间高度重新连接的蛋白质是否与有害表型相关。值得注意的是,作者发现疾病基因在组织中的重新连接明显多于相互作用组平均值(图6J)。因此,作者利用了与组织特异性病理相关的疾病基因资源研究这些基因的蛋白质产物是否在疾病相关组织的相互作用组中优先相互连接,事实上,疾病相关组织中疾病基因之间的平均最短路径明显更小(图6K),表明形成了组织特异性疾病模块。Cryab是一种具有内在紊乱的C末端片段的热激活蛋白,与许多神经系统疾病有关。Iqgap2是一种轴突生长所需的多功能信号蛋白。Cryab和Iqgap2之间的相互作用提供了组织间疾病基因重连的例子。PCP-SILAM在大脑中检测到此种相互作用,但未在肾脏或肌肉中检测到此种相互作用,尽管相互作用的蛋白质在所有三种组织中都有很强的表达(图6L)。

总之,这些分析突出了无序区域内的蛋白质结合基序和翻译后修饰位点在介导不同生理环境的相互作用重组中的作用。由此产生的组织特异性相互作用与组织特异性信号通路中生物信息的传递有关。高度重新连接的蛋白质受到多种细胞聚合机制的严格调控,这可能是为了确保生物信息流的保真度。但是疾病基因之间相互作用重组的速度提高,这意味着疾病病理生理学中这种调控级联的功能发生障碍。值得注意的是,疾病基因在具有疾病表现的组织的相互作用组中优先相互连接,这表明绘制背景特异性相互作用组对于阐明疾病模块和病理生物学的基础至关重要。

Discussion

总而言之,本研究中提出的定量蛋白质组学方法PCP-SILAM的优势在于它是一种无针对性且相对无偏见的技术。并且,作为一种用于体内相互作用组图谱的高通量技术,PCP-SILAM特别适合发现多种生理条件下的相互作用,以研究体内多个不同组织相互作用组的重组。由此产生的相互作用组包含先前未映射的区域和小鼠相互作用组内的功能类别,并将研究不足的小鼠蛋白质置于组织特定的功能环境中,这表明PCP-SILAM将是一种有价值的方法,可以阐明蛋白质组中知之甚少的成分。

Limitations of the study

首先,作者发现与仅基于光通道的量化相比,基于SILAM比率的蛋白质量化的技术精度较高。然而,这种比较受到以下事实的限制:

1)在没有任何同位素标记的实验中,蛋白质定量的动态范围预计会更高,这无法与无标记实验进行直接地比较。

2)虽然此处确定的125,00种独特相互作用中的绝大多数以前没有在小鼠中报道过,但其中一些以前已经在人类中发现过。

3)一个更广泛的限制是这里分析的七种组织每个都由多种不同的细胞类型组成,这些细胞类型也有自己的细胞类型特异性相互作用组。未来开展以提高体内相互作用组映射到细胞亚群水平的分辨率的工作是必要的。

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绘图系列|R-VennDiagram包绘制韦恩图 – 云+社区 – 腾讯云

绘图系列|R-VennDiagram包绘制韦恩图

2020-08-06阅读 1.2K0

本版块会持续分享一些常用的结果展示的图形。

在得到数据之后,我们经常会用到维恩图来展示各个数据集之间的重叠关系。本文简单的介绍R语言中的VennDiagram包绘制数据集的维恩图。

一 需要安装和导入的包

install.packages("VennDiagram")
library(grid)
library(VennDiagram)

二 使用函数及参数

所有参数说明详见https://cran.r-project.org/web/packages/VennDiagram/VennDiagram.pdf

可以看到参数有很多,不用担心,下文的例子会给出常用的调整参数以及说明。

三 知道各个数据集的个数以及重叠(交叉)的个数

2.1 两个已知数据集的韦恩图

# 圆的大小不会根据数据量多少改变
venn.plot <- draw.pairwise.venn(80, 30, 10, c("First", "Second"), scaled =FALSE)
grid.draw(venn.plot)

# 圆的大小根据数据量多少改变

venn.plot <- draw.pairwise.venn(80, 30, 10, c(“First”, “Second”))

grid.draw(venn.plot)

#调整参数进行图形优化

venn.plot <- draw.pairwise.venn(  area1 = 80,  #区域1的数 
area2 = 30,   #区域2的数 
cross.area = 2,  #重叠的个数 
category = c("First", "Second"),#分类命名
fill = c("blue", "red"),#1 2 区域分别的填充颜色 
lty = "blank",  #1 2 区域的边框线类型 
cex = 2,        #1 2 区域内部数字的字体大小 
cat.cex = 2,    # 分类名称的字体大小 
cat.dist = 0.09,   #分类名称距离边的距离 实际调整 
cat.just = list(c(-1, -1), c(1, 1)),  #分类名称的位置  ,圈内或者圈外
ext.pos = 30,  #线的角度 默认是正上方12点位置 
ext.dist = -0.05,   #外部线的距离  跟根据圆圈的大小适当调整
ext.length = 0.85,  #外部线长度 
ext.line.lwd = 2,  #外部线的宽度 
ext.line.lty = "dashed" )  #外部线为虚线);
grid.draw(venn.plot)

2.2 三个已知数据集的韦恩图

venn.plot <- draw.triple.venn(area1 = 80,area2 = 70,area3 = 50,n12 = 38,n23 = 18,n13 = 28,n123 = 8,category = c("First", "Second", "Third"),fill = c("blue", "red", "green"),lty = "blank",cex = 2,cat.cex = 2,cat.col = c("blue", "red", "green"))
grid.draw(venn.plot)

四 根据数据集合绘制韦恩图

4.1 四个数据集合

A <- sample(1:1000, 500, replace = FALSE);
B <- sample(1:1000, 600, replace = FALSE);
C <- sample(1:1000, 700, replace = FALSE);
D <- sample(1:1000, 800, replace = FALSE);
E <- sample(1:1000, 900, replace = FALSE);
venn.plot <- venn.diagram(#数据列表
x = list(A = A,B = B,C = C,D = D),
filename = "Venn_4set.tiff",    #保存路径
col = "transparent",      #指定图形的圆周边缘颜色  transparent 透明          
fill = c("blue", "green", "yellow", "grey50"),  #填充颜色
alpha = 0.50,     #透明度
label.col = c("orange", "white", "grey50", "white","white", "white", "white", "white", "darkblue", "white","white", "white", "white", "darkgreen", "white"),
cex = 1.2,    #每个区域label名称的大小
cat.col = c("darkblue", "darkgreen", "orange", "grey50"),  #分类颜色
cat.cex = 1.2,      #每个分类名称大小
cat.dist = 0.07,   
cat.pos = 0,        #
cat.fontfamily = "serif",     #分类字体
rotation.degree = 270,        #旋转角度
margin = 0.2 )   

4.2 五个数据集合

venn.plot <- venn.diagram( 
x = list(    A = A,    B = B,    C = C,    D = D,    E = E  ), 
filename = "Venn_5set.tiff", 
col = "black", 
fill = c("dodgerblue", "goldenrod1", "darkorange1", "seagreen3", "orchid3"), 
alpha = 0.50, 
cat.col = c("darkblue", "darkgreen", "orange", "grey50","purple"), 
cat.cex = 1.5, 
cat.fontface = "bold", 
margin = 0.05);

VennDiagram函数包最大能绘制5个数据集合的韦恩图,可以看到已经有点乱了,当更多集合的时候,可以使用之前分享的R|UpSet-集合可视化进行绘制。

韦恩图,走你。

本文分享自微信公众号 – 生信补给站(Bioinfo_R_Python),作者:MJ

原文出处及转载信息见文内详细说明,如有侵权,请联系 yunjia_community@tencent.com 删除。

原始发表时间:2019-03-20

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【R】clusterProfiler的GO/KEGG富集分析用法小结 – 小xuo生 – 博客园

【R】clusterProfiler的GO/KEGG富集分析用法小结

前言

关于clusterProfiler这个R包就不介绍了,网红教授宣传得很成功,功能也比较强大,主要是做GO和KEGG的功能富集及其可视化。简单总结下用法,以后用时可直接找来用。

首先考虑一个问题:clusterProfiler做GO和KEGG富集分析的注释信息来自哪里?

GO的注释信息来自Bioconductor,提供了19个物种的org类型的GO注释信息,如下表所示。Bioconductor中更多的注释包可参考http://www.bioconductor.org/packages/release/data/annotation/,很乱,大多数我都不知道干啥用的。

packages organism
org.Ag.eg.db Anopheles
org.At.tair.db Arabidopsis
org.Bt.eg.db Bovine
org.Ce.eg.db Worm
org.Cf.eg.db Canine
org.Dm.eg.db Fly
org.Dr.eg.db Zebrafish
org.EcK12.eg.db E coli strain K12
org.EcSakai.eg.db E coli strain Sakai
org.Gg.eg.db Chicken
org.Hs.eg.db Human
org.Mm.eg.db Mouse
org.Mmu.eg.db Rhesus
org.Pf.plasmo.db Malaria
org.Pt.eg.db Chimp
org.Rn.eg.db Rat
org.Sc.sgd.db Yeast
org.Ss.eg.db Pig
org.Xl.eg.db Xenopus

KEGG的注释信息clusterProfiler通过KEGG 数据库的API来获取,https://www.kegg.jp/kegg/rest/keggapi.html

首先是一个物种所有基因对应的pathway注释文件,比如人的:http://rest.kegg.jp/link/hsa/pathway
其次还需要pathway对应的描述信息,比如人的:
http://rest.kegg.jp/list/pathway/hsa

关于KEGG数据库全部的物种及其简写(三个字母)如下列表:
https://www.genome.jp/kegg/catalog/org_list.html

因此对于以上已有pathway注释的物种,只需要将物种简写输入给clusterProfiler, 它会通过联网自动获取该物种的pathway注释信息。

以上都是有物种信息的情况,那么对于无物种信息的项目怎么办?

GO可以通过读取外部的GO注释文件进行分析。关于基因的GO注释,interproscan、eggnog-mapper和blas2go等软件都可以做,不过输出格式有些不同。clusterProfiler需要导入的GO注释文件的格式如下:

GeneID GO GO_Description
1 GO:0005819 spindle
2 GO:0072686 mitotic spindle
3 GO:0000776 kinetochore

需要包含以上三列信息,这3列信息任意顺序都可。

clusterProfiler包只针对含有OrgDb对象,如果是公共数据库中有该物种注释信息,只是未制作成org.db数据库(标准注释库),则可以不需要从头注释,只需手动制作org.db数据库类型,完成后直接使用即可,代码如下:

source("https://bioconductor.org/biocLite.R")
if (!requireNamespace("BiocManager", quietly = TRUE))
  install.packages("BiocManager")

BiocManager::install("AnnotationHub") # 一个包含大量注释信息的数据库,里面有很多物种及来源于很多数据库的注释信息。
BiocManager::install("biomaRt")

library(AnnotationHub) 
library(biomaRt)

hub <- AnnotationHub() #建立AnnotationHub对象(视人品,网不行加载不了)
# unique(hub$species) #查看AnonotationHub里面物种
hub$species[which(hub$species=="Solanum")] #看AnonotationHub里是否包含想要的物种
# Solanum是番茄的拉丁名
query(hub, "Solanum")  #查看该物种信息
hub[hub$species=="Solanum" & hub$rdataclass == "OrgDb"] #OrgDb属于rdataclass中,因此查看下该物种有没有OrgDb
Solanum.OrgDb <- hub[["AH59087"]]#AH59087是番茄对应的编号
#制作为标准注释库,就可和模式生物一样使用了

同样地,对于pathway数据库中没有的物种,也支持读取基因的pathway注释文件,然后进行分析,注释文件的格式如下:

GeneID Pathway Path_Description
1 ko:00001 spindle
2 ko:00002 mitotic spindle
3 ko:00003 kinetochore

以上三列信息的顺序也是任意的。

富集分析

通常用的富集分析有ORA、FCS和拓扑三种方法。ORA简单来说就是超几何检验或Fisher精确检验,大同小异,都符合超几何检验,这也是目前用的最多的方法,优劣不谈。FCS的代表就是GSEA,即基因集富集分析,优劣亦不谈。clusterProfiler提供了这两种富集分析方法。
1. ORA(Over-Representation Analysis)
GO富集参考代码:

#标准富集分析
ego <- enrichGO(
          gene  = gene$entrzID,
          keyType = "ENTREZID", 
          universe = names(geneList), #背景基因集,可省
          OrgDb   = org.Hs.eg.db,
          ont     = "CC",
          pAdjustMethod = "BH",
          pvalueCutoff  = 0.01,
          qvalueCutoff  = 0.05,
          readable      = TRUE)

#通过导入外部注释文件富集分析
data <- read.table("go_annotation.txt",header = T,sep = "t")
go2gene <- data[, c(2, 1)]
go2name <- data[, c(2, 3)]
x <- enricher(gene,TERM2GENE = go2gene,TERM2NAME = go2name)

gene差异基因对应的向量;
keyType指定基因ID的类型,默认为ENTREZID, 可参考keytypes(org.Hs.eg.db)类型 ;
OrgDb指定该物种对应的org包的名字;
ont代表GO的3大类别,BP, CC, MF,也可是全部ALL;
pAdjustMethod指定多重假设检验矫正的方法,有“ holm”, “hochberg”, “hommel”, “bonferroni”, “BH”, “BY”, “fdr”, “none”中的一种;
cufoff指定对应的阈值;
readable=TRUE代表将基因ID转换为gene symbol。

KEGG Pathway富集参考代码:

#标准富集分析
ego <- enrichKEGG(
          gene = gene,
          keyType = "kegg",
          organism  = 'hsa',
          pvalueCutoff  = 0.05,
          pAdjustMethod  = "BH",
          qvalueCutoff  = 0.05
)


#通过外部导入注释文件富集
data <- read.table("pathway_annotation.txt",header = T,sep = "t")
go2gene <- data[, c(2, 1)]
go2name <- data[, c(2, 3)]
x <- enricher(gene,TERM2GENE = go2gene,TERM2NAME = go2name)

默认基因ID为kegg gene id,也可以是ncbi-geneid, ncbi-proteinid, uniprot等。
organism物种对应的三字母缩写,其他参数同GO富集。ID转换函数:

library(clusterProfiler)
bitr_kegg("1",fromType = "kegg",toType = 'ncbi-proteinid',organism='hsa')

library(org.Hs.eg.db)
keytypes(org.Hs.eg.db) #支持的ID类型
bitr(gene, fromType = "ENTREZID", toType = c("ENSEMBL", "SYMBOL"), OrgDb = org.Hs.eg.db)

#以上看出ID转换输入时,可以向量的形式,也可以单列基因名list导入,也可以是内置数据
gene <- c("AASDH","ABCB11","ADAM12","ADAMTS16","ADAMTS18")
gene  <-  data$V1 #字符串

data(geneList, package="DOSE") #富集分析的背景基因集
gene <- names(geneList)[abs(geneList) > 2]

2. GSEA(Gene Set Enrichment Analysis)
GO富集参考代码:

#标准富集分析
ego <- gseGO(
      geneList  = geneList,
      OrgDb  = org.Hs.eg.db,
      ont  = "CC",
      nPerm  = 1000,  #置换检验的置换次数
      minGSSize  = 100,
      maxGSSize  = 500,
      pvalueCutoff = 0.05,
      verbose  = FALSE)

#通过导入外部注释文件富集分析参考代码:
data <- read.table("go_annotation.txt",header = T,sep = "t")
go2gene <- data[, c(2, 1)]
go2name <- data[, c(2, 3)]
x <- GSEA(gene,TERM2GENE = go2gene,TERM2NAME = go2name)

KEGG Pathway富集参考代码:

#标准富集分析
kk <- gseKEGG(
  geneList  = gene,
  keyType  = 'kegg',
  organism = 'hsa',
  nPerm  = 1000,
  minGSSize = 10,
  maxGSSize = 500,
  pvalueCutoff = 0.05,
  pAdjustMethod     = "BH"
)

#通过外部导入注释文件富集
data <- read.table("pathway_annotation.txt",header = T,sep = "t")
go2gene <- data[, c(2, 1)]
go2name <- data[, c(2, 3)]
x <- GSEA(gene,TERM2GENE = go2gene,TERM2NAME = go2name)

可视化

1.GO富集分析结果可视化

#barplot
barplot(ego, showCategory = 10) #默认展示显著富集的top10个,即p.adjust最小的10个

#dotplot
dotplot(ego, showCategory = 10)

#DAG有向无环图
plotGOgraph(ego)  #矩形代表富集到的top10个GO terms, 颜色从黄色过滤到红色,对应p值从大到小。

#igraph布局的DAG
goplot(ego)

#GO terms关系网络图(通过差异基因关联)
emapplot(ego, showCategory = 30)

#GO term与差异基因关系网络图
cnetplot(ego, showCategory = 5)

2.Pathway富集分析结果可视化

#barplot
barplot(kk, showCategory = 10)

#dotplot
dotplot(kk, showCategory = 10)

#pathway关系网络图(通过差异基因关联)
emapplot(kk,  showCategory = 30)

#pathway与差异基因关系网络图
cnetplot(kk, showCategory = 5)

#pathway映射
browseKEGG(kk, "hsa04934") #在pathway通路图上标记富集到的基因,会链接到KEGG官网

Ref:
https://blog.csdn.net/weixin_43569478/article/details/83744242
https://blog.csdn.net/weixin_43569478/article/details/83744384
https://www.jianshu.com/p/065d38c28e2d
https://www.jianshu.com/p/47b5ea646932
https://www.cnblogs.com/yatouhetademao/p/8018252.html
https://zhuanlan.zhihu.com/p/35510434

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生信学习第5天-1 – 知乎

生信学习第5天-1

被时间追杀的童鞋

miRNA交互背景知识

数据库miRBase:

功能:提供miRNA的序列以及注释的查询;

提供miRNA在基因组的定位,茎环结构序列的完整信息;

操作:输入miRNA的名称;根据物种选择基因名

(该数据库仅包含验证过的靶标信息,所以会出现部分miRNA信息无的现象)

stem-loop sequence :茎环序列 (紫色部分:为成熟的miRNA序列)

点击get sequence,可以获得fast格式的序列

deep sequence,给出了2条miRNA测序的深度。一般高丰度的那条,为guidestraint,该序列为这条miRNA的序列。

miRNA靶基因预测原理:

  1. 序列互补性:(不完全互补配对)
  • miRNA 5‘端种子序列(即第2-8个碱基)与靶基因3’UTR可形成Watson-Crick配对是所有miRNA靶基因预测原理中最重要的因素。
  • 也有报道表明,miRNA除了与mRNA的3‘UTR结合,还能与5’UTR和CDS区结合发挥作用,但是目前甚少数据库使用此算法。

2. 序列保守性:

  • 若miRNA结合位点在多个物种之间具有保守性,则该位点更可能为miRNA的靶位点(如:TargetScan,miRanda)

3. 热动力学因素

  • 计算miRNA与target mRNA结合位点形成的自由能,自由能越低,其可能性越大(miRanda, RNAhybird)

4. 位点的可结合性

  • mRNA的二级结构影响其与miRNA结合形成双链结构的能力(如:PITA)

5. 结合位点的位置以及碱基分布

miRNA结合位点在基因UTR区的位置以及相应位置的碱基分布同样影响miRNA与靶基因的结合,也会影响RISC的效率(如:TargetScan)

此外,miRNA的分布与靶基因组织分布的相关性也是靶基因预测时需要考虑的重要因素(miRNA的表达具有组织特异性)

miRNA预测靶基因数据库

TargetScan:通过搜索和每条miRNA种子序列匹配的保守的8mer和7mer位点来预测靶基因。该数据库支持通过MiRNA预测靶基因,也支持通过mRNA预测相关的miRNA

miRTARbase:主要收集经实验验证的miRNA靶标,该数据库可以通过不同方面进行查询,例如miRNA,gene, disease, pathway等。

Starbase/ENCORI:综合数据库,可进行miRNA-靶标预测,RNA-RNA分析,ceRNA网络分析,RNA结合蛋白分析等。(人,小鼠,线虫)

miRNA:可以作用的分子:

mRNA,LncRNA,circRNA,pseudogene,sncRNA

miRNA预测LncRNA/miRNA预测通路

Lncbase:专门记录lncRNA与miRNA相互作用的数据库,分成实验证据支持和软件预测两部分结果

miRpathDB2.0(人+鼠):预测miRNA的靶基因(预测的+已验证的),并通过GO,KEGG预测miRNA可能参与的信号通路

miRNA调控网络构建

miRWalk:既可以通过miRNA预测靶基因,也可以通过gene预测与之结合的miRNA;支持多个miRNA或gene同时预测

miRNA实验验证方法:

间接调控关系:

确定有表型的miRNA分子——分析miRNA表达差异情况(包括细胞水平和组织水平检测;RNA用定量PCR)——制备miRNA过表达或者抑制的实验工具(定量PCR检测过表达或者沉默效率)——细胞功能表型实验——动物水平表型验证——Rescue实验

miRNA实验验证方法

直接交互关系

miRNA负向调节靶基因的表达检测——在细胞株中过表达miRNA,然后qPCR,WB检测候选靶点的表达。筛选出miRNA过表达后表达下调的候选靶点

荧光素酶报告基因实验——将候选靶基因的3′-UTR插入荧光素酶基因的3‘端,转染细胞,同时过表达miRNA。如果miRNA对靶基因的3’UTR是有结合和抑制翻译作用的,荧光素酶表达量会减少,对底物荧光对 值就会减低,这样就能获得证据证明miRNA与靶基因3‘-UTR是有结合的。

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5’UTR miRNA targeting added to the epigenetic landscape

5′ UTR miRNA Targeting

July 21, 2014

The nightly news lately makes it seem like the world has gone upside down, and now we’ve got some science to back it. Honglei Zhou and Isidore Rigoutsos from Thomas Jefferson University recently revealed that mammalian miRNA targeting doesn’t always limit itself to 3′ miRNA action. It now seems that in addition to the traditional 3’UTR targeting, mammals are starting to look a bit more like plants as they also target a number of the 5′ untranslated region (5′ UTR) and amino acid coding sequence (CDS) sites.

To help the notion of 5′ UTR to catch some steam the team characterized two (miR-103a-3p) target sites in the 5′ UTR of GPRC5A, a two-faced cancer gene. Here’s what they found:

  • The interaction of miR-103a-3p with the 5′ UTR targets reduces the expression levels of both GPRC5A mRNA and GPRC5A protein.
  • This naturally occurring miRNA target of the 5’UTR goes down in a seed-depedent manner.
  • Interestingly, by ectopically expressing miRNA sponges that contain 5′ UTR targets they are able to reduce miR-103a-3p levels and increase GPRC5A mRNA and protein levels.

Overall, this research offers a rare glimpse into the post-transcriptional regulation of a tumor suppressor/oncogene and highlights the complexity of miRNA targeting.

Zhou and Rigoutsos (CC BY-NC 4.0)

Getting Into 5’UTR and CDS target sites

Senior researcher Isidore Rigoutsos shares that “Back in 2006 we provided evidence that CDS and 5’UTR sites are also abundant in addition to the 3’UTR ones. Then we and many other people showed examples of CDS targets starting in 2008 and by now there are a few dozen papers showing CDS targets. 5’UTR targets seemed harder to come by: to date I know of only six reports that show 5’UTR miRNA targeting (in 2 of the six the targeting leads to up-regulation whereas in the other four it leads to down-regulation). In my opinion what has limited the discovery of CDS and 5’UTR targets is not their relative absence compared to 3’UTR targets but the fact that the vast majority of the miRNA target prediction tools focus on the 3’UTR. Our own rna22 algorithm is an exception to this in that it can work with any region of messenger RNA and in fact with any transcript (coding and non-coding).”

Make sure your research is on target in RNA, July 2014

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microRNA 招募eIF4E2 抑制靶mRNA 翻译—-中国科学院生物物理所高光侠实验室

microRNA 招募eIF4E2 抑制靶mRNA 翻译—-中国科学院生物物理所高光侠实验室

课题组简介
    高光侠课题组隶属于中国科学院感染与免疫重点实验室。主要研究以HIV为代表的逆转录病毒与宿主相互作用的分子机理(具体见研究方向)。课题负责人高光侠研究员自2001年入选中科院“百人计划”以来,主持国家级项目13项,参与国家级项目12项,代表性成果发表在《Science》、《Cell》、《 Cell Host & Microbe》、《PNAS》等国际学术期刊。
    本实验室具备先进的的研究设备、研究条件和良好的学术环境。同国内外相关实验室建立了密切的合作关系。欢迎品学兼优,热爱生命科学的年轻人加入我们的研究队伍。
microRNA 招募eIF4E2 抑制靶mRNA 翻译
2017-07-18 | 【     】【打印】【关闭

  2017年7月18日, Protein & Cell 杂志在线发表了高光侠课题组论文“MicroRNAs recruit eIF4E2 to repress translation of target mRNAs”。该成果发现microRNA 招募eIF4E2 抑制靶mRNA 翻译。

  microRNA(miRNAs) 是一种22nt左右的小的非编码RNA,它通过与AGO, TNRC6等因子形成RNA诱导沉默复合体 (RNA-induced silencing complex, RISC),结合到mRNA的3’UTR上抑制其翻译并且/或者促进mRNA的降解,从而降低蛋白的表达。有报道认为mRNA的5’UTR高级结构对miRNA的抑制功能十分重要,而eIF4A的同源蛋白eIF4A2与此相关。mRNA的5’帽子结构对于miRNA介导的翻译抑制也被证明十分重要,但具体机制尚不清晰。

  利用体外转录的mRNA报告系统,我们发现mRNA的5’UTR和5’帽子结构都是miRNA发挥功能所需要的,而且二者是独立发挥功能的。此外,RISC核心组分TNRC6A与翻译起始因子eIF4E的同源蛋白eIF4E2存在直接的相互作用。eIF4E2与eIF4E相比,都可以结合mRNA的5’帽子结构,但不能结合eIF4G,所以不能起始翻译。eIF4E2的敲低会削弱miRNA对reporter系统的抑制功能;同时也会上调IMP1,PTEN,PDCD4等内源miRNA的目标基因的蛋白表达;在polysome profile实验中,eIF4E2的敲低会显著削弱miRNA在翻译水平上的抑制。此外,我们还发现miRNA会促进eIF4E2结合更多的目标mRNA,同时使得eIF4E结合的mRNA比例下降。由此,我们认为miRNA招募eIF4E2与eIF4E竞争结合mRNA,从而抑制目标mRNA的翻译。

  

  图示:eIF4E2 参与microRNA 翻译抑制作用模式图

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遇事不要慌,不花钱让洁碧洗牙器 wp-112起死回生记_牙线_什么值得买


遇事不要慌,不花钱让洁碧洗牙器 wp-112起死回生记

2021-04-25 14:58:59
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海淘货说坏就坏

逛值站久了,在张大妈的谆谆善诱下,海淘了一台洁碧洗牙器 wp-112,由于是110V电压的,还专门配了一个220v转110v的舜红变压器插座。用了2年半时间,挽救了我中度的牙龈炎不断扩大的牙缝,每餐饭后食物、菜渣塞在牙缝里,非得冲出来才得劲。比牙线方便,不伤牙龈,用后口气清爽。

然而,在一个早上,洁碧洗牙器咕噜了一会,不出水了,拍打了几下,断断续续出了一阵水,力度也不大了。最后,彻底歇菜了,无论怎么拍,也一动不动了。当时因高度依赖冲牙器而带来的焦虑症犯了,不冲牙,我怎么出去见人,别人会不会闻到我的口臭而捂鼻子呢?再说这大几百的洋货说坏就坏,不甘心呀,但之前贪便宜选择海淘货,就意味着没售后没保修,这是不争的事实。怎么办?猜想一下故障原因,也许是我在水箱里放了盐冲牙堵塞了管子,也许是机身进水了,也许是机械缺油卡住了,也许是电源部分烧了,也许是电机坏了等等,总之结果就是没有冲牙器用了。

维修对策及实操

好在社区里还有值友发的自己动手丰衣足食修理冲牙器的文章,临时抱佛脚,找找解决的办法。王九组的《维修DIY 篇一:Waterpik 洁碧 美版 WP-660 水牙线 插错电压 维修指南》等帖子对我启发很大。链接如下

恶补修理知识之后,还是要动动手拆开才行,将机子翻过来,用长杆十字起子拧出底部的5颗螺丝,用尖嘴钳扯出档位旋钮,底盖才能打开。小心翼翼通电后,用万用表测了电源部分,有110V的电压,电源没坏。这怎么跟帖子说的不一样,别人都是换个电源模块就好了,而且这110V,还不能用12V电源适配器直接替代法。那就有可能是电机或水泵坏了,看看电机铭牌是110V的DF315XLG,这种电机不好配,某宝上只有几家卖,最便宜的也要42,贵的要100多。

抽出电路板,松开线路的约束,再拧开靠电机一侧的4颗螺丝,向上一提,电机和白色的尼龙齿轮就拿出来了,看看齿轮箱,黄油没有干涸,手拨电机齿轮,卡住了,估计这就是故障原因。拿出家中常备的WD-40除锈润滑剂,对着电机轴眼一顿狂喷,浸润轴头,多到可以洗澡了。终于,在WD-40的高效润滑下,电机可以拨动了,将电机另一头的的轴眼也喷了WD-40。然后,按照拆卸的反顺序,将部件逐一装回去。通电,打开开关,熟悉的咕噜声响起,修好了!起死回生。

总结和一举反三

复盘一下,洁碧洗牙器长期放置在浴室,水汽大,金属部件易生锈。电机每分钟5千转高速运转,长时间后,电机轴承极易缺油而卡死,造成整个洗牙器停摆。预防的办法,每年打开机箱一次,电机轴用WD-40除锈润滑,齿轮箱里补充黄油,最好是用食用级润滑脂。这样就可以延年益寿了,海淘货也能用的安心舒适。最后补充一下,洁碧洗牙器,英系的,容易坏电源部分,美系的,容易坏电机和水泵部分。我这台就是美系的。

文章很值,打赏犒劳作者一下

打赏“首席”打赏官正虚席以待!

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(1) Does anyone have IHC Profiler experience?

(1) Does anyone have IHC Profiler experience?

September 7, 2018
Hi Alison,
Another student in our group was working with this program recently. My understanding of “positive/low positive” categories is that they are arbitrary divisions of the intensity values – so they may not be appropriate objective metrics depending on y​o​
… 
January 18
Hi Alison,
I have found the same problem. I’m analysing soft tissue slide and some of positive control slide not result positive with the IHC Profiler. How did you solve it?
Elvan Wiyarta added an answer
February 10
Hi Alison,
I also experienced the same thing in the past. Do you do an individual analysis of each image? If so, sometimes individual analyzes can produce errors like this. I also don’t understand why this error can occur. However, I have a solution to avoid this error with batch processing.
Batch processing is a mechanism within ImageJ that allows users to perform multiple image analysis at once. To do so, try to follow my protocol:
1. You need to prepare the image that you will process. This means that you need to “crop to a region of interest to exclude background” on all images first.
2. After all the images are ready. Put the image in one or more folders according to your needs.
3. Click Process> batch> macro and the batch process window will appear.
4. Select the input folder containing the image you wish to analyze. Remember, you can only batch process one folder at a time! So if you are working in multiple folders, you need to do batch processing equal to the number of your folders.
5. Select the output folder where you want it. Basically, this output folder will contain the logs and histograms of the analysis of all the images in your input.
6. Set the output format according to your needs. I usually don’t change the settings for “output format”, “add macro code”, and “file name contain”.
7. Under the file name contains, there will be a large empty space. It’s where you put your batch processing code. Each protocol has a different code. I have coded your protocol as the following:
run (“IHC Profiler”, “mode = [Cytoplasmic Stained Image] vectors = [H DAB]”);
8. After that click process, than the log and histogram window will start batch processing all the images in your input file.
This batch processing has two advantages. The first is to streamline your work on image analysis. Second, for some reason, if you use this batch processing, the error that you asked about earlier will not occur.
I hope my answer helps. I’ve also included my publications if you’d like to read more ( https://www.phcogj.com/article/1326 ). Contact me if you have further questions. Cheers!

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ImageJ实用技巧——免疫组化分析(定量分析篇) – 知乎

ImageJ实用技巧——免疫组化分析(定量分析篇)

北漂4年,沪漂ing

在临床病理诊断中, 免疫组织化学( Immunohistochemistry, IHC) 是一种很重要的技术和手段。

免疫组化标记时细胞阳性着色程度取决于抗原含量、分布密度和标记方法及其敏感性。

一般而言,抗原含量越多,分布密度越高,阳性结果显色则越强。根据阳性标记的显色程度分为:蓝色,阴性;淡黄色,弱阳性;棕黄色,中等阳性;深棕色,强阳性。

免疫组化原理图

免疫组化分析主要有两种方法,阳性着色细胞计数法和染色强度评分法。前者是在光学显微镜下,随机多个视野下计数阳性着色细胞;后者则是在下按染色强度和染色阳性范围评分,最终分数相加。

但组织样品的病理学分析仍然是耗时且主观的程序,其中人工判断染色强度来评分,直接受到视觉偏差的影响[1]。且阳性细胞计数往往不能自动化进行,导致免疫组化分析费时费力。


这篇文章会怎么利用ImageJ进行免疫组化分析,进行全面的讲解,包括两部分:

1、利用IHC Profiler插件对样本的染色情况进行自动化评分;

2、利用Trainable Weka Segmentation插件分别对阳性细胞和阴性细胞进行计数;


一、IHC Profiler-自动分析染色情况

IHC Profiler,将阳性细胞的平均灰度值(染色强度)和阳性面积百分比(染色面积)共同作为 IHC 测量指标[2],最终给出四种评分:High positive (3+), Positive (2+), Low Positive (1+) and Negative (0)。

1、插件安装

注意:Fiji和IHC Profiler会出现不兼容的情况,导致结果错误,建议在ImageJ1中安装这个插件并使用。

ImageJ1的下载链接:

https://imagej.nih.gov/ij/download.html

该插件的安装包括插件和宏的安装,下载地址:

IHC Profiler​sourceforge.net

若无法打开可以在GitHub上下载到:

https://github.com/inanezhao/ImageJ-Tutorial/blob/master/IHC_Profiler.zip

压缩包里包含下面三个文件插件文件夹、宏文件以及官方安装教程:

(1)插件安装

将IHC Profiler文件夹放在Plugins中,重启ImageJ即可安装IHC Profiler插件:

(2)宏安装(对于Fiji是必需且重要的)

Fiji安装宏的步骤和网传的版本不同,因为IHC Profiler是基于ImageJ最初的版本编写的,在FIji上使用的时候会有不兼容的情况。

首先将IHC_Profiler.txt文件放到macros文件夹中。

然后点击Plugins -> Macros -> Install,选择该txt文件(如果是ImageJ1则跳过这一步)

即可在Plugins -> Macros中找到该宏:

注意!!!每次关闭ImageJ后,再次使用IHC Profiler需要重新安装该宏。否则得出的结果是错误的。

2、插件使用

该插件的基本原理为先对染色图片进行颜色去卷积,分出蓝色的阴性区域和棕色的阳性区域,然后判断染色类型是细胞质染色还是细胞核染色,再分别进行对应的操作[2]。

插件工作流程

(1)以细胞质染色为例:

打开图片和插件(Plugins -> IHC_Profiler)

打开插件后选择细胞质染色的Mode:

颜色去卷积默认H DAB染色:

然后即可分别得到阴性区域和阳性区域,直接得出结果:

(2)以细胞核染色为例:

选择细胞核染色Mode,并不会直接得出结果,需要先设定一个阈值:

然后点击上面安装的宏(Plugins -> Macros -> IHC_Profiler),即可得到结果:


二、Trainable Weka Segmentation-自动阳性细胞计数

该插件的使用请参考这篇文章:

一般的免疫组化图片不能通过Threshold的方法进行分割,需要利用该插件,基于机器学习算法,做到阳性细胞和阴性细胞的计数。

例如统计上图中,阳性细胞和阴性细胞的数量,经过训练之后分类器可以很好的分出阳性细胞、阴性细胞以及背景(甚至可以区分出强阳性和弱阳性细胞):

点击Create result、Get Probability可以得到分割后的图像:

通过Analyze Particles可以快速得到细胞的数量,可以参考这篇文章:

三、总结

该篇文章完整讲述了怎么利用IHC Profiler进行免疫组化分析,补充了利用Trainable Weka Segmentation对阳性细胞进行自动统计。

以后对于免疫组化分析,不必再过度依赖人工,可以通过软件的自动分析得到更加直观和稳定的数据。但前提是样品的制备、染色以及拍照时要注意避免假阳性。

与此同时,在使用插件的时候要多思考,多研究,避免出现分析错误的情况。(例如,若不安装IHC Profiler的宏文件,得出的结果会完全相反)

推荐阅读介绍IHC Profiler的这篇文献[2],以更深入地了解自动免疫组化分析的原理。

四、补充

(1)插件报错问题

如果插件出现报错等不能用的情况,建议换用ImageJ1来安装这个插件,在ImageJ1中使用,而不是Fiji。

(2)共染问题

免疫组化共染不能用IHC Profiler来进行分析,这个插件现在只包含了DAB。

如果想要分析共染的荧光强度的话,比较好的方法是通过Colour Deconvolution(Image -> Color -> Colour Deconvolution)

选择H&E DAB把粉红色、棕色以及蓝色,三个通道分别分离出来(但要注意免疫组化本身并不是化学计量的)。

通道分割结果

可以参考下面这个网站:

Colour-deconvolution​blog.bham.ac.uk

参考文献:

[1].Jensen, Ellen C . Quantitative Analysis of Histological Staining and Fluorescence Using ImageJ[J]. The Anatomical Record, 2013, 296(3):378-381.

[2].Varghese F, Bukhari A B, Malhotra R, et al. IHC Profiler: An Open Source Plugin for the Quantitative Evaluation and Automated Scoring of Immunohistochemistry Images of Human Tissue Samples[J]. Plos One, 2014, 9(5):e96801.


如果对于ImageJ使用有什么问题可以私信我,或者给我发邮件:zhaoyc9@163.com

更多教程可以关注我的专栏:

希望对大家有帮助~

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【免疫组化分析法】色彩分割+机器学习! – 云+社区 – 腾讯云

【免疫组化分析法】色彩分割+机器学习!

2020-09-23阅读 4620

聊点学术

免疫组化定量分析是科研人的传统艺能!之前,个人一直推荐采用Image Pro Plus (IPP)进行测量。

IPP测量时对染色效果要求较高。其原理是在HSI模式下,通过参数设定或调节直方图波形曲线的方法来选定阳性表达区。详情见→【聊点学术】既往精彩原创汇总

当背景染色较强或者细胞核较多时,上述方法操作起来比较费力。

(背景染色太深)

(细胞核多)

今天要说的是基于Image J的 “色彩分割法机器学习”进行免疫组化定量分析。关键插件为IHC Toolbox,由英国诺丁汉大学的两位大牛开发。

原理1: 自动化将棕色(DAB)和蓝色(苏木素)色彩分割,这样就可以直接快捷地测量阳性区。

原理2:机器学习模式帮助image J精准识别阳性表达物(棕色)

图文教程

1. 下载安装FiJi版本image J,接下来要用到其中的插件IHC Toolbox ,否则无法进行后续操作。

(image J开源软件下载地址:https://imagej.net/Fiji) (IHC Toolbox下载地址:https://imagej.nih.gov/ij/plugins/ihc-toolbox/index.html)。

2. 将下载好的IHC Toolbox插件复制到fiji安装位置的plugins文件夹。重启软件之后就可以在plugins中找到IHC Toolbox插件了。

3. 打开一张IHC图片,然后点击plugins,选择IHC Toolbox。

4. 在弹窗中先选择自带的H-DAB(即苏木素-DAB),然后再点击color。

5. 此时就获得了分割后的图像。可以看到右图所有的蓝色已基本被去除。

6. 如果对插件自带的H-DAB色彩分割不满意。此时,可以点击左侧的Training,鼠标光标会变成十字架。

7. 然后在原图中拉一个矩形框选阳性区时会跳出弹窗,觉得有小误差可以拉动滑条调整。确定好之后点击collection。

【机器学习】重复在此图或者同批次的其它图片上进行此步骤操作,每做完一次就点击collection。一般操作约5-10次左右插件即可完成学习。然后点击Save_Model保存,所有学习内容会自动默认到H-DAB模式中,后续测量直接调用H-DAB即可。

本文分享自微信公众号 – 聊点学术(SingForScience),作者:Mark

原文出处及转载信息见文内详细说明,如有侵权,请联系 yunjia_community@tencent.com 删除。

原始发表时间:2020-09-13

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