骨髓间充质干细胞经验总结- 实验基础- 百通生物—干细胞培养专题—丁香园会议频道

骨髓间充质干细胞经验总结

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发布日期:2012-06-16 13:01 文章来源:丁香园

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2003年8月,为给大家提供一个网上交流干细胞研究经验的平台,我们干细胞版设立了骨髓间充质干细胞培养讨论区,经过近三个月的讨论学习,我们既学习丰富了自己的知识体系,也对间充质干细胞尤其是分离培养方面有了更为翔实的认识,为了大家阅读的方便,我们决定把本版中的相关内容,同时参考部分书目和文献,做一总结。

一、骨髓间充质干细胞的分离

目前常用的分离MSC的方法有全骨髓法和密度梯度离心法,全骨髓法即根据干细胞贴壁特性,定期换液除去不贴壁细胞,从而达到纯化MSC的目的。密度梯度离心法即根据骨髓中细胞成分比重的不同,提取单核细胞进行贴壁培养。随着对MSC表面抗原认识的深入,有人利用免疫方法如流式细胞仪法、免疫磁珠法等对其进行分离纯化,但经过流式或磁珠分选后的细胞出现了增殖缓慢等一些问题,加之耗费较大和技术的难度,在某种程度上限制了这些方法的广泛应用。

1.    直接培养法(全骨髓培养法)

1987年,Friedenstein等发现在塑料培养皿中培养的贴壁的骨髓单个核细胞在一定条件下可分化为成骨细胞、成软骨细胞、脂肪细胞和成肌细胞,而且这些细胞扩增20-30代后仍能保持其多向分化潜能,这类细胞即为骨髓间充质干细胞(BMSC),其工作对今后MSC的研究具有重要意义,不仅证实了骨髓MSC的存在,而且创建了一种体外分离和培养MSC的简便可行的方法,得到了广泛的应用。

culture-spirit采用直接贴壁法,24-36小时首次换液,换液时用PBS洗两次,7-10天传第一代,以后2-3天传代。培养基采用Hyclone的DMEM/F-12(1:1),血清是天津TBD的FBS(顶级),得到了较好的培养结果。

布兰卡根据自己培养大鼠MSC的经验,详细介绍了实验步骤:

(1)接种后60-80分钟,换液去除悬浮细胞

(2)原代培养24h,48h各换液一次

(3)观察细胞情况,在原代培养7天左右时,如观察到成片的典型形态的细胞,在瓶底用Marker笔标记,0.25%胰酶消化,镜下观察控制,约5-10分钟(室温太低时应放置到孵箱中),加入全培养基终止消化,瓶体朝上,吸管轻轻吹打4-8分钟,尤其是标记部位。不要用力吹打,以免把贴壁较牢的成纤维细胞,上皮样细胞吹打下来

(4)传代到新瓶中,加入少量培养基,孵箱静置20-30分钟后,MSC大多牢固贴壁。瓶底朝上,轻轻吹打,丢弃悬浮以及贴壁不牢的细胞(大多是上皮样细胞),加入全培养基开始传代培养,如观察仍有较多杂细胞,可重复上述步骤。

(5)经上述处理后,原代的那瓶细胞仍有一些MSC生长,可继续按原代培养,如观察到MSC的克隆,仍可按上述步骤纯化处理。

(6)原代或传代的细胞如观察的少量成片的杂细胞,可直接镜下瓶底标记后,超净台里用长吸管尖端机械刮除,吸出去掉。

菊花与刀用的是全骨髓培养法,直接用含10%的FBS培养基冲洗大鼠的股骨和胫骨,为了避免冲起许多气泡应缓慢冲,冲的次数不应太多。冲洗后不用离心直接接种在培养瓶里,48h~72h后首次换液,一般7~10天可传代。

天之饺子介绍的小鼠MSC的分离方法:取6w小鼠的股骨和胫骨,直接用含培养基冲出骨髓,一定要尽量把干垢端的骨髓冲干净。冲洗后不离心直接接种在培养瓶里,24-48h后去悬浮,再接下来的每3-4天换液一次,直到需要传代。

2.  密度梯度离心法

裴雪涛等用比重为1.073g/ml的percoll分离(400g×20min)人骨髓MSCs,取界面处细胞层,离心后洗涤以2×105/cm2的密度接种,72h后更换培养液,弃掉未贴壁细胞,以后每3d换液一次。细胞长到80%汇合时1:1传代。

菊花与刀利用PERCOLL密度1.073分离大鼠MSC 时,用2400rpm×20mins后可见中间有一层约1~2mm厚的白色层,仔细用吸管吸取这一层再用PBS离心2遍即可加培养基和胎牛血清培养即rMSCs,。

周进明等利用密度为1.082的percoll分离小鼠MSCs,500g×30min离心后,取中间的单个核细胞层,PBS洗两次,接种于IMDM培养基,1d后换液,去掉非贴壁细胞,以后每3-4天换液。

jetter用过FICOLL,FERCOLL,上海二分厂的淋巴细胞分离液分离MSC细胞效果都不错,当然所获细胞群的纯度不一,Percoll最纯,而上海二分厂的淋巴细胞分离液所获细胞群的传代能力优秀(35 PASSAGE)。

本版的部分园友认为MSC贴壁培养得到的细胞不均一,但是多能分化能力和增殖力好,percoll分离得到的细胞较为均一,多能分化性和增殖力不如贴壁培养的,尤其是增殖力相差很远,有人添加bFGF或/和表皮生长因子发现可以增强增殖能力。

二、 骨髓间充质干细胞的培养

天之饺子认为,间质干细胞的培养一定要用塑料培养瓶,不能用玻璃的。因为象间质干这类的基质细胞不易贴玻璃,而且现在买的进口好品牌的培养瓶都涂有一层促细胞贴壁的物质,多数园友培养时都添加10-15%胎牛血清。

分离培养结果的差异可能是由于各个研究小组标本来源、采用的分离方法不同从而所获得的细胞不同,或者用来检测的细胞代数不同,或者培养过程中用的胎牛血清不同,导致MSCs获得或失去这些表面标记物的表达。

三、 骨髓间充质干细胞的特性

体外培养的MSC体积小,成梭形,核浆比大。不表达分化相关的细胞标志,如I、II、III型胶原、碱性磷酸酶或Osteopontin;也不表达SH2、SH3、CD29、CD44、CD71、CD90、CD106、CD120a、CD124、CD166和多种表面蛋白,这群细胞特性稳定,扩增一代和两代后的细胞同质性分别达到95%和98%。MSC联系传代培养和冷冻保存后仍能具有多向分化潜能,而且保持正常的核型核端粒酶活性,但不易自发分化,在体外特定的诱导条件下,MSC可以分化为骨、软骨、脂肪、肌腱、肌肉、神经等多种细胞。

四、其他相关内容

Jiang将从成人以及成年大鼠和小鼠骨髓分离的间充质干细胞(CD45-TER119-)命名为多潜能成年祖细胞,他们证明,MAPC高表达端粒酶,而且随着细胞的扩增,端粒的长度不变,单个MAPC来源的细胞群不仅能在体外向3个胚层的细胞分化,而且能在体内能够向各种组织细胞分化,相比较而言,形态与MSC相似的体外培养的皮肤成纤维细胞则不具有类似的分化潜能。

参考文献

生理学报2003.55(2):153-159

人骨髓间充质干细胞在成年大鼠脑内的迁移及分化

中华放射医学与防护杂志.2002,22(3).-167-169

培养小鼠骨髓间充质干细胞及其移植后在体内的定位分布

Exp Biol Med Vol. 226(6):507-520, 2001

Mesenchymal Stem Cells

NATURE |VOL 418 | 4 JULY 2002

Pluripotency of mesenchymal stem cells derived from adult marrow

编辑: gaowei2010

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使用STEM程序分析基因表达的时间趋势并划分聚类群

使用STEM程序分析基因表达的时间趋势并划分聚类群

编者荐语:

最近可能会用到,学习一下

以下文章来源于小白鱼的生统笔记
,作者生信小白鱼 鲤小白

使用STEM程序分析基因表达的时间趋势并划分聚类群

前两篇分别介绍了使用Mfuzz包TCseq包在具有时间序列特点的转录组、蛋白质组数据中分析基因或蛋白表达的时间趋势,并将具有相似表达模式的基因或蛋白划分聚类。这两种方法都是R语言程序包。但如果您不习惯用R,但仍期望实现类似的功能(时间趋势分析、聚类以及可视化作图等),本篇再继续介绍一个图形界面程序,短时间序列表达挖掘器(Short Time-series Expression Miner,STEM),它在很多文献中也常见到。

STEM是一个Java程序,可用于聚类、比较和可视化来自短时间序列(一般在8个时间点以内)的基因表达数据,识别重要的时间表达谱以及与这些谱相关的基因。同时,STEM还可以对具有相同时间表达模式的基因集执行功能富集分析,例如Gene Ontology(GO)富集。事实上,只要是带有“梯度”的数据,理论上都可以使用STEM进行分析,而非仅局限于时间序列,如剂量响应试验等,按“梯度”顺序排列好样本后也可以作为STEM的输入。

接下来简单展示STEM的使用。

安装STEM程序

STEM官网:http://www.cs.cmu.edu/~jernst/stem/

运行STEM需要Java环境支持,需要首先确保您电脑中已经安装了Java。如果尚未安装,可在STEM官网的主界面点击对应的链接下载安装Java。

之后,在STEM官网中点击对应的链接下载STEM程序包。下载下来是一个压缩包形式,解压后点击其中的“stem.jar”即可执行STEM主程序。

使用STEM分析基因表达的时间趋势并划分聚类群的简单演示

1、数据准备

首先您需要准备带有“梯度”的数据,这里以一个基因表达值的时序数据为例,第一列是基因名称,随后几列是各基因在各时间样本中的表达值信息,时间样本按时间顺序依次排列。

2、数据加载和STEM参数设置

在STEM主界面中加载数据,设置合适的参数后,运行分析。

界面的第一部分“1. Expression Data info”中,点击“Browse”加载数据。点击“View Data File”可查看已加载的数据,如果您有生物学重复,可再通过“Repeat Data”指定加载。随后,可选指定一种数据标准化方式。

界面的第二部分“2. Gene info”用于指定加载基因注释信息文件,以便在后续获得聚类后,对目标聚类群内的基因集执行富集分析,如GO、KEGG功能分析等。这里先忽略此功能,我们先将此处留空,下文会再提到这一点。

界面的第三部分“3. Option”用于设置聚类选项,如聚类方法选择(STEM聚类、或者K-means聚类)以及聚类参数等(具体细节随方法而不同)。在“Advanced Options”中可修改更多高级参数,如过滤基因选项、与评估聚类重要性有关的选项、与基因注释有关的选项等。

设置完毕后,点击第四部分的“Execute”执行分析。

3、时间趋势分析和聚类结果

STEM自动弹出分析结果,显示了基因表达的时间动力学聚类的概况。每个折线图代表一个聚类群,相似时间动力学模式的基因被划分到同一聚类群中,折线图趋势代表了该聚类群中基因随时间表达的整体走向。对于具有统计意义(显著时间特征)的聚类群,以彩色背景突出。每个折线图左上方数字是该聚类群的名称,点击特定的折线图将显示该聚类群的统计显著性p值、所包含基因的数量以及每个基因随时间表达的趋势折线图。

在界面中点击“Main Gene Table”,即可将所有基因划分的聚类群名称连同它们的表达值信息一并输出。

若期望同时对各聚类群的基因执行功能富集分析

如果您恰好分析的是基因表达谱数据,STEM也基于超几何分布的原理提供了对目标基因集执行富集分析的方法,但是基因功能注释(如GO、KEGG等)信息需要手动添加。

1、数据准备

除了准备基因表达值矩阵外,还需要提供基因的功能注释分类信息,例如这里添加了基因的GO功能注释表。基因注释表无需表头,共两列,第一列是基因名称,第二列是基因功能注释。基因注释表原则上应包含背景基因在内。

2、数据加载和STEM参数设置

程序界面中,“1. Expression Data info”和“3. Option”的数据加载、标准化以及聚类参数选择等,和上述操作过程一致,不再多说。

但此时需要在“2. Gene info”中指定加载基因注释信息文件,以便在后续获得聚类后,对目标聚类群内的基因集执行富集分析。

设置完毕后,点击“Execute”执行分析。

3、时间趋势分析和聚类结果

类似地,对于聚类结果的描述可参考上文。

不过此时,将在各聚类群中增添了基因的功能富集分析结果,此处是以GO富集为例的展示。在结果界面点击“Profile GO table”即可查看GO富集分析的统计详情,以及输出至本地。

其它功能

以上仅对STEM执行时序数据的聚类以及基因功能富集分析的方法做了简单演示。更多的功能由于使用不多,这里不再提及。例如在上文STEM的主程序界面中,在“2. Gene info”中也提供了基因位置信息的录入窗口,可据此绘制目标基因在染色体中的分布图(如下样式,来自STEM操作手册的示例图)。如果您对更多功能感兴趣,可自行学习STEM操作手册(http://www.cs.cmu.edu/~jernst/stem/STEMmanual.pdf)。

友情链接

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MeSH加Cytoscape你也可以绘制超高颜值富集图

MeSH加Cytoscape你也可以绘制超高颜值富集图

原创

生信技能树



生信技能树


3月19日

收录于话题
#​cytoscape的十大插件

12个

最近实验室同学在组会上分享了一篇很有意思的文章,是于  January 2021,  发表在CELL杂志的文章《Spliceosome-targeted therapies trigger an antiviral immune response in triple-negative breast cancer》,链接是:https://doi.org/10.1016/j.cell.2020.12.031

里面的GO/KEGG等生物学数据库富集注释被替换成为了 MeSH terms 的富集,而且结果还很酷炫,如下所示:

酷炫的富集分析

我看了看,文章里面的关于这个图的图例写的是:B) MeSH term enrichment analysis of top 50 resistance candidates. Enriched MeSH terms (FDR <0.1) grouped by related function. Node size represents number of shRNAs that significantly conferred resistance (R4 significant shRNAs highlighted in yellow).

也就是说,每一个基因都有一个值,就是它被多少个shRNAs所靶向,这个文章使用的是forward genetic screen with a short hairpin RNA (shRNA) library (18,370 shRNAs targeting 1,837 genes) ,它根据基因的shRNAs靶向情况把基因排序后,选取top50个基因,进行功能注释。

50个基因在附件

如下所示:

50个基因在附件

那么MeSH是何方神圣呢,我在公众号《 Y叔叔  YuLabSMU  2018-11-01》看到了这个:文章发表:Using meshes for MeSH term enrichment and semantic analyses,提示我们MeSH是个体量比GO还大的生物医学注释库,嘱咐总盯着GO看,有好多很好的注释库,都没什么人在用,比如MeSH就可以给大家提供不同的角度,挖掘不同的信息,不防试试。

步骤如下:

  • Analysis of over-represented Medical Subject Headings (MeSH) was performed using the R package ‘‘meshes’’ (v1.8.0) (Yu, 2018) with the following parameters: MeSHDb = ‘MeSH.Hsa.eg.db’, database = ‘gene2pubmed’ and category = ‘C’.
  • For Cytoscape visualization, individual genes in MeSH term categories were set as nodes and common MeSH terms as edges.

也就是说,首先你得下载和安装meshes这个包,然后使用里面的函数进行MeSH terms 的富集。

作者的MeSH富集结果也在附件

Table S2. Resistance Candidate MeSH Enrichment, Related to Figure 2

MeSH富集结果也在附件

我这里就不给出来代码了,作为一个学徒作业,反正这50个基因大家可以去文章附件复制粘贴拿到,然后R包meshes呢自己摸索一下,做一个富集。我还没有来得及看这个包,不过我猜想应该是跟Y叔的其它包其它函数用法类似,大家都是成熟的生信工程师了,该学会自己看文档了!加油!

如果是普通的富集分析

就可以使用下面的代码,当然了,也是有不同的数据库可以选择:

# 自己想办法读取 文章附件的50个基因,并且针对symbol转为ENTREZID
library(ggplot2)
library(clusterProfiler)
library(org.Hs.eg.db)
# top50基因
df <- bitr(unique(top50), fromType = "SYMBOL",
           toType = c( "ENTREZID" ,'GENENAME'),
           OrgDb = org.Hs.eg.db)
head(df)  
# 存储为 df 这个对象 
gene_up=df$ENTREZID
enrichKK <- enrichKEGG(gene         =  gene_up,
                       organism     = 'hsa',
                       #universe     = gene_all,
                       pvalueCutoff = 0.1,
                       qvalueCutoff =0.1)
head(enrichKK)[,1:6] 
dotplot(enrichKK)
enrichKK=DOSE::setReadable(enrichKK, OrgDb='org.Hs.eg.db',keyType='ENTREZID')
enrichKK 

比如文章的下图,就选择了 Reactome  这个数据库:

Reactome数据库注释结果

(A) Immune signaling pathway components are enriched among genes that confer resistance to spliceosome inhibition. StringDB functional enrichment analysis was performed on the top 50 SD6 resistance candidates identified by the shRNA screen. Functionally enriched Reactome Pathways with FDR < 0.001 are shown.

但是图例里面又出来了 StringDB  这个新花样!

还有一个Cytoscape的可视化

其中主要是 Table S2. Resistance Candidate MeSH Enrichment  里面的结果的解析,本身呢,Y叔的包也是提供类似的网路可视化,就是一般人想通过代码来提高颜值确实是困难,那么成熟的工具比如Cytoscape就是一个很好的选择:

至少我一般都是看了看官方文档而已:

#(3)可视化
#条带图
par(mfrow=c(2,1))
barplot(enrichKK,showCategory=20)
#气泡图
dotplot(enrichKK)
#下面的图需要映射颜色,设置和示例数据一样的geneList
# geneList = deg$logFC
# names(geneList)=deg$ENTREZID
# geneList = sort(geneList,decreasing = T)
#(3)展示top5通路的共同基因,要放大看。
#Gene-Concept Network  
cnetplot(enrichKK)

做出来的图一般来说颜值都不咋地,不过仍然是强推Y叔clusterProfiler的一些可视化方法,函数列表:

  • barplot
  • cnetplot
  • dotplot
  • emapplot
  • gseaplot
  • goplot
  • upsetplot

好几个都是以前没有介绍过的,有趣的是我准备浏览这些可视化函数的帮助文档的时候,看到了这样的话:

重点来了,Y叔特意为其包写了一本书来介绍其用法。Please go to https://yulab-smu.github.io/clusterProfiler-book/ for the full vignette.

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