Nature | 细胞中醚磷脂合成影响铁死亡的敏感性

Nature | 细胞中醚磷脂合成影响铁死亡的敏感性

原创 王初课题组CW 王初课题组 5天前

大家好,今天推荐发表在Nature上的文章,本文的通讯作者有三位,第一位是来自美国哈佛大学,化学与化学生物学系的教授Stuart L.Schreiber,他是化学生物学领域的顶级科学家,最近他们课题组主要研究诱导铁死亡细胞的脂质类型。第二位是来自whitehead 生物研究所的Robert A. Weinberg教授。他是癌症领域的顶级科学家,也是各大媒体预测的2011年诺贝尔奖获得者候选人之一。最后一位是Yilong Zou博士。在这篇工作中作者发现过氧化物酶体合成的多不饱和醚磷脂是控制铁死亡易感性的关键因素。

铁死亡是一种铁依赖的非凋亡细胞死亡过程。在近年来的研究过程中,研究者们发现它对不同的细胞的敏感性不同。其中,作者认为铁死亡敏感细胞跟它本身所在的谱系的遗传因素具有关联,而一些不太敏感的细胞,也可以在细胞转变的过程变得敏感。所以细胞是如何动态调节对铁死亡的敏感性的,目前还没有报道。

为了找到调控铁死亡敏感的源头,作者做了两组独立的基因组CRISPR-Cas9筛选。作者选用了两种对铁死亡敏感的细胞模型,一种是肾癌细胞模型(ccRCC)786-O细胞,一种是重度血浆性卵巢癌细胞模型OVCAR-8细胞。试验通过加入GPX4蛋白的抑制剂ML210或者RSL3来引起细胞发生铁死亡。实验结果发现,ACSL4蛋白在每一组中都被发现是铁死亡的显著调节剂,所以作者认为该方法真实可靠。

作者发现在之前人们没有鉴定到的这些基因中,蛋白酶体的组分被更多的富集到。其中包括了PEX10、PEX3和PEX12。他们分别是编码磷酸烷基甘油合成酶AGPS、脂肪酰基辅酶A还原酶FAR1和磷酸甘油O型酰基转移酶(GNPAT)的基因。随即作者将他们在两种细胞中敲除,发现细胞中的过氧化物酶体显著的减少了,并且降低了由于GPX4的抑制导致的细胞铁死亡的敏感性。而过表达则会出现相反的结果。

在细胞中,过氧化物酶体主要起到解毒胞内的活性氧(ROS)分子,并启动长链和支链的脂肪酸降解。除此之外过氧化物酶体还参与醚键连接的甘油酯的合成。跟酯键连接的二酰基甘油酯不同,它在甘油的sn-1位置连接了一个醚基。醚磷脂包含两个组分,一个部分是1-O-烷基-甘油磷脂,另一个组分是1-O-烯基-甘油磷脂,就是被熟知的缩醛磷脂。通过脂质组学的分析,作者发现在敲除了PEX3和PEX10的细胞中,醚磷脂会选择性的消失。

随后作者通过回补实验和抑制剂的作用证实了,降低醚磷脂的水平可以保护细胞不易被抑制GPX4活性而导致铁死亡的发生。有趣的是,去掉细胞中的醚磷脂并不会导致ACSL4或者溶血磷脂酰胆碱酰基转移酶3(LPCAT3)这两种限速酶的水平发生明显变化。而双敲则会对铁死亡产生进一步的保护作用。这些结果说明了醚磷脂的生物合成是促进铁死亡发生不可或缺的一个组成部分。并且可以通过抑制ACSL4和PUFA-ePL的生物合成来抑制铁死亡的发生。实验的最后证明了降低PUFA-ePL的癌细胞可以逃逸铁死亡,神经元细胞和心肌细胞在分化的过程中PUFA-ePL的含量增加,从而导致了铁死亡的发生。

总之,本篇文章通过CRISPR-Cas9对诱导铁死亡的细胞进行基因组的筛选,发现合成醚磷脂的基因显著调控铁死亡过程。最终发现醚磷脂的合成对铁死亡的敏感性至关重要。

本文作者:WYK

责任编辑:CY

原文链接:https://www.nature.com/articles/s41586-020-2732-8

原文引用:10.1038/s41586-020-2732-8

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颌面部高清血管解剖图谱

颌面部高清血管解剖图谱

2017-10-15 18:50

随着微整形的火热流行,玻尿酸注射误入血管的事件时有发生,甚至造成严重后果,作为微整形医生,有必要熟练掌握颌面部血管的走形路线及层次,尽最大可能避免将玻尿酸注射到血管,从而避免严重并发症的发生。下面分享一组颌面部的血管解剖图谱,仅供参考。

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用CRISPR建稳定细胞系的方法之讨论

优质用CRISPR建稳定细胞系的方法之讨论

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freecell楼主

发布于 2016-03-04 22:40

只看楼主

这个帖子发布于 4 年零 192 天前,其中的信息可能已发生改变或有所发展。

Q: 以前用CRISPR,都是用在原代细胞上,因为转染效率极低,所以,只有用lentivirus来做。

现在我要建立几个KO的stable cell line(不是用原代细胞做)。

首先,不经过仔细思考的办法,就是用LentiCrispr的慢病毒来做,然后加puro筛选。但是,这个方法不好的地方是,Cas9一直表达,时间长了,off target肯定会比较多。后来觉得,用Tet On的promoter来控制Cas9的表达,这样只在短时间内表达,应该会好很多。

后来再一想,这个gene edit,本来就是permanent的。没必要用lentivirus来,这lentivirus还会整合到genome里,顺便破坏哪个基因还不晓得。为什么不直接用transfection呢?唯一可能的问题就是效率可能低了点。还有可能问题的,瞬时transfection,通常每个细胞的plasmid会很多,这样Cas9的量太高了,会不会又会增加off target的概率?

大家一般是首选什么策略?

A1: 也可以用别的不整合的virus

A2: 可以考虑用Cas9的mRNA

A3: gRNA不用lenti不就行了

A4: 干嘛这么麻烦,用CRISPR质粒 (px330系列)transient表达Cas9和gRNA,同时转两个,KO效率还是很高的。

如果要做整合,用lenti表达Cas9, 再转入gRNA就是了。不过lenti-Cas9的titer较低,整合效率不高。

A5: Tet-on promoter does NOT work very well.

A6: [没做过,弱问transient transfection之后怎么分离KO的clone?]

共转带Puro/GFP的质粒,用单个Crispr的1:4甚至更少,然后筛选。

A7: 楼主如果细胞能够进行单细胞筛选,那我强烈推荐用sgRNA+Cas9 protein做RNP complex

这个complex打电转效率很高,很推荐用paired guide可以做deletion,容易探测,不存在质粒系统中像楼主提到的问题,我们用CD34+细胞可以达到90%的target effiency

我们用in vitro transcribed的sgRNA+ Cas9 protein室温incubate 15min 然后加到neon transfection打电转。

Cas9 protein有家公司叫PNA bio有卖, thermo也有类似的product

附件里pdf文件是跟我们类似的protocol

A8: [搭车问一下,Crispr建立可诱导基因敲除细胞株的protocol在哪有?]

inducible目前不好做可以稳转Cas9+ inducible sgRNA,这个是目前我觉得最靠谱的.至于inducible Cas9之前有兄弟说了不一定work,我们的经验是还会有Cas9的leakness.

[A9] [没做过,弱问transient transfection之后怎么分离KO的clone?]

用PURO或者GFP筛选一下下,然后从剩下的里面的里面筛单克隆,效率还挺高的。不过这都是建立在transfection效率还不错的基础上

[A10] [请问你用paired guide时,用的是wt cas9,还是用的Cas9 nickase mutant?]

我们用的是wt cas9

Rapid and highly efficient mammalian cell engineering via Cas9 protein transfection PUBLICATION.pdf (1.9 MB)

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实验室最毒的16种试剂!一定要了解

1 DMSO 二甲基亚砜

△ 二甲亚砜球棍模型

DMSO是二甲基亚砜,用途广泛。用作乙炔、芳烃、二氧化硫及其他气体的溶剂以及腈纶纤维纺丝溶剂。是一种即溶于水又溶于有机溶剂的极为重要的非质子极性溶剂。对皮肤有极强的渗透性,有助于药物向人体渗透。也可作为农药的添加剂。也是一种十分重要的化学试剂。

DMSO也是一种渗透性保护剂,能够降低细胞冰点,减少冰晶的形成,减轻自由基对细胞损害,改变生物膜对电解质、药物、毒物和代谢产物的通透性。但是研究表明,DMSO存在严重的毒性作用,与蛋白质疏水集团发生作用,导致蛋白质变性,具有血管毒性和肝肾毒性。

防护措施

DMSO是毒性比较强的东西,用的时候要避免其挥发,要准备1%-5%的氨水备用,皮肤沾上之后要用大量的水洗以及稀氨水洗涤。最为常见的为恶心、呕吐、皮疹及在皮肤、和呼出的气体中发出大蒜、洋葱、牡蛎味。

2 EB 溴化乙锭

△溴化乙锭分子式

溴化乙锭是一种高度灵敏的荧光染色剂,用于观察琼脂糖和聚丙烯酰胺凝胶中的DNA。溴化乙锭用标准302nm 紫外光透射仪激发并放射出橙红色信号,观察琼脂糖凝胶中DNA最常用的方法是利用荧光染料溴化乙锭进行染色。

溴化乙锭是强诱变剂,具有高致癌性!会在60-70度时蒸发(所以最好不要在胶太热的时候加,或者应该加到液体 里,0.5ug/ml,染色半小时)(当EB加得过多时,也可以在室温用水将已染色的凝胶浸泡20min以降低未结合的EB引起的背景荧光)。

防护措施

由于溴化乙锭具有一定的毒性,实验结束后,应对含EB的溶液进行净化处理再行弃置,以避免污染环境和危害人体健康。

3 DEPC 二乙基焦炭酸酯

DEPC 即二乙基焦碳酸酯(diethylprocarbonate),可灭活各种蛋白质,是RNA酶的强抑制剂,是一种潜在的致癌物质。

防护措施

在操作中应尽量在通风的条件下进行,并避免接触皮肤。DEPC毒性并不是很强,但吸入的毒性是最强的,使用时戴口罩。不小心占到手上注意立即冲洗。

Acrylamide 丙烯酰胺

△ 根据香港消费者委员会的研究,含碳水化合物的食物在经油炸之后,都会产生丙烯酰胺。

属中等毒性物质,可通过皮肤吸收及呼吸道进入人体,丙烯酰胺的危害主要是引起神经毒性,同时还有生殖、发育毒性。神经毒性作用表现为周围神经退行性变化和脑中涉及学习、记忆和其他认知功能部位的退行性变化,试验还显示丙烯酰胺是一种可能致癌物,职业接触人群的流行病学观察表明,长期低剂量接触丙烯酰胺会出现嗜睡、情绪和记忆改变、幻觉和震颤等症状,伴随末梢神经病如手套样感觉、出汗 和肌肉无力。累积毒性,不容易排毒。

防护措施

在搬运和使用中必须穿戴好防护用具,如防毒服,防毒口罩及防毒手套等

5  DTT 二硫苏糖醇

是一种小分子有机还原剂,散发难闻的气味。可因吸入、咽下或皮肤吸收而危害健康。

防护措施

当使用固体或高浓度储存液时,戴手套和护目镜,在通风橱中操作。

6 TEMED 四甲基乙二胺

四甲基乙二胺是一种无色透明的液体,有微腥臭味,在分子生物学中,可以用于配制SDS-PAGE胶。TEMED可以催化APS产生自由基,从而加速聚丙烯酰胺凝胶的聚合,可作为一种促凝剂使用 。

防护措施

防止误吸,操作时快速,存放时密封。

7 PMSF 苯甲基磺酰氟

苯甲基磺酰氟一种高强度毒性的胆碱酯酶抑制剂。白色至微黄色针状结晶或粉末。对湿敏感。难溶于水,且在水溶液中非常不稳定,容易分解。可溶于异丙醇、乙醇、甲醇、二甲苯和石油醚。它对呼吸道黏膜、眼睛和皮肤有非常大的破坏性。可因吸入、咽下或皮肤吸收而致命。

防护措施

戴合适的手套和安全眼镜,始终在化学通风橱里使用。在接触到的情况下,要立即用大量的水冲洗眼睛或皮肤,已污染的工 作服丢弃掉。

CHCl3 三氯甲烷

对皮肤、眼睛、黏膜和呼吸道有刺激作用。它是一种致癌剂,可损害肝和肾。它也易挥发,避免吸入挥发的气体。操作时戴合适的手套和安全眼镜并始终在化学通风橱里进行。

防护措施

操作时戴合适的手套和安全眼镜并始终在化学通风橱里进行。

9  HCHO 甲醛

△ 甲醛的介绍海报

有很大的毒性并易挥发,也是一种致癌剂。很容易通过皮肤吸收,对眼睛、黏膜和上呼吸道有刺激和损伤作用。避免吸入其挥发的汽雾。

防护措施

要戴合适的手套和安全眼镜。始终在化学通风橱内进行操作。远离热、火花及明火。

10 Giemsa 吉姆萨

△ 吉姆萨染液

染料咽下可致命或引起眼睛失明,通过吸入和皮肤吸收是有毒的。其可能的危险是不可逆的效应。

防护措施

戴合适的手套和安全护目镜。在化学通风橱里操作,不要吸入其粉末。

11 NaN3 叠氮钠

△用于汽车的安全气囊中,当发生车祸时迅速分解放出氮气,使安全气囊充气。

毒性非常大。它阻断细胞色素电子运送系统。含有叠氮钠的溶液要标记清楚。可因吸入、咽下或皮肤吸收而损害健康。戴合适的手套和安全护目镜,操作时要格外小心。

防护措施

戴合适的手套和安全护目镜,操作时要格外小心。

12  SDS 十二烷基硫酸钠

有毒,是一种刺激物,并造成对眼睛的严重损伤的危险。可因吸入、咽下或皮肤吸收而损害健康。

防护措施

戴合适的手套和安全护目镜,不要吸入其粉末。

13  TCA 三氯乙酸

有很强的腐蚀性,戴合适的手套和安全防目镜。

防护措施

戴合适的手套和安全防目镜。

14 Triton X-100 聚乙二醇辛基苯基醚

引起严重的眼睛刺激和灼伤。可因吸入、咽下或皮肤吸收而受害。戴合适的手套和护目镜。

防护措施

戴合适的手套和护目镜。

15  APS  过硫酸铵

对黏膜和上呼吸道组织、眼睛和皮肤有极大危害性。吸入可致命。

防护措施

操作时戴合适的手套、安全眼镜和防护服。始终在通风橱里操作,操作完后彻底洗手。

16  Trizol试剂

含有毒物质苯酚,如皮肤接触Trizol请立即用大量去垢剂和水冲洗,如仍有不适,请听取医生意见。如果只是少量接触,并处理后症状减轻,估计问题就不大了。

防护措施

请立即用大量去垢剂和水冲洗,如仍有不适,请听取医生意见。

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基于光固化水凝胶的轻量化3D细胞培养方案

基于光固化水凝胶的轻量化3D细胞培养方案

原创

EFL



EngineeringForLife


6天前

收录于话题

#EFL产品(细胞培养、3D打印)

11个

组织工程极大地影响了基础生物学研究和生物医学技术的发展过程。长期以来,这些研究绝大多数都依赖于培养瓶、培养皿或孔板中常规二维(2D)细胞培养的实验结果。但是,这些2D培养结果可能与体内3D细胞外基质内细胞生长的实际情况大不相同,甚至完全相反。3D细胞培养由于其更高的准确性和真实性而发挥着越来越重要的作用,未来3D培养的实验数据将会很大程度上取代2D培养的数据来佐证很多研究的意义及价值。

然而,迄今为止3D培养技术还局限在一些有限的实验室,没有被广大生物及医学科研工作者所掌握及使用。3D培养的操作方法能否像2D培养一样简单,成为生化实验室的常规方法?目前2D细胞培养已形成了从培养到后处理和表征的全套近乎标准的流程,这是2D培养如此流行的根本原因。

近日,EFLBio-Designand Manufacturing期刊发表了题为Facile 3D cell culture protocolbased on photocurable hydrogels的Technical Note,给出了一种基于光固化水凝胶的轻量化3D细胞培养方案,谢明君博士为第一作者,贺永教授为通讯作者。研究人员通过系列的工具包括多型号的光固化水凝胶,固化环,可控光源和水凝胶裂解液实现3D细胞培养的简单、量化及可控。

图1 轻量化的3D细胞培养流程

 

工作流程

步骤一:Bioink制备

在实际的有机体中,不同的组织拥有具有特定成分和强度的基质,以实现一系列生物学功能。因此,就3D细胞培养而言,首先要考虑的因素是ECM的选择。用于体外3D培养的合适ECM具有三个主要要求:生物相容性水凝胶基底、合适的强度和其他必要的ECM成分。在这里,GelMA水凝胶因其出色的生物相容性和成型能力而被选作本文体外3D培养的ECM基础。根据体内的实际组织选择具有适当取代度和其他必要成分的GelMA水凝胶。例如,如果研究人员想在3D环境中培养肝细胞,则需要选择合适的GelMA类型,使其固化后可达到6-8kPa的拉伸模量。另外,需要将肝脏组织的无细胞基质添加到GelMA前驱液中。就软骨细胞而言,研究人员需要添加足够的透明质酸以实现其相关的生物学功能。选择了GelMA和其他成分后,通过将冻干的GelMA溶解在磷酸盐缓冲盐水(PBS)中,制备合适的浓度,该溶液包含光引发剂(LAP)和选择的添加物。从培养瓶中分离细胞,并用制备的溶液重悬以形成生物墨水。

 

第二步:在3D环境中培养

在培养过程中,一方面,3D细胞培养需要全方位的物质交换空间,因此样品必须漂浮在培养基中,而不是简单地沉入培养皿底部。另一方面,尽管交联的GelMA水凝胶具有较高的生物相容性,但其机械强度较低,特别是具有较低取代度的墨水。这些3D样本总是太软,以致于无法在培养过程中保持初始形状并无法在随后的表征中进行操作。因此,考虑到这些难题,我们发明了固化环。将制备好的生物墨水浇筑到固化环上并用可定时的蓝光光源使其交联。固化环上的把手或支撑脚可以方便在操作时抓取样品,并为物质交换形成更大的空间,更密的固化环网格可以保持较低模量的交联GelMA的形状。

 

第三步:细胞回收

培养一段时间后,可以对样品进行后处理以进行细胞表征和分析。处理后的3D样本中存在两种情况。一方面,某些样品中的水凝胶无需降解,可以对细胞进行简单处理,例如对细胞产物进行染色,可以在光学显微镜或共聚焦荧光显微镜下直接观察染色的样品。另外,在某些生物学测试项目中,例如流式细胞仪(FCM),聚合酶链反应(PCR),酶联免疫吸附测定(ELISA)等,必须使用水凝胶分离3D样品中的细胞。因此,我们设计了GelMA裂解液,使固化的GelMA降解而不会损坏细胞,回收的细胞可用于这些表征当中。

 

第四步:生物学表征

通过回收的细胞,研究人员可以进行一系列生物学测试项目,例如显微镜观察,FCM,ELISA,PCR等。根据这些测试和分析结果,研究人员可以得出3D细胞体外培养数据,并可进一步估计不同刺激因素在相关生物医学应用中的作用。

 

为了检查提出的3D细胞培养方案的可行性,我们以这种3D培养方式培养了不同种类的细胞,包括人脐静脉内皮细胞(HUVEC),大鼠脂肪来源干细胞(rat-ADSC),人骨间充质干细胞(hBMSC)并测试了它们的存活率,伸展能力和分化。用5%(w/v)EFL-GM-60和0.5%(w/v)LAP制备GelMA前驱液。将HUVECss,大鼠ADSC和hBMSC分别混入其中并在EFL-SCR-2D-24-2固化环上固化。在完全培养基中培养HUVEC和大鼠ADSC,在成骨诱导培养基中培养hBMSC。观察发现,包裹的大鼠ADSC和hBMSC在培养的第一天和第七天都显示出高存活率。从固化环的光镜图像中,我们可以发现细胞均匀地分布在交联的GelMA内部的3D空间中。此外,包裹的细胞在培养7天后会在3D环境中扩散。该结果表明,在提出的3D培养方案中,包裹在3D固化环上的GelMA中的细胞可以保持较高的存活率和伸展能力。

 

图2 3D培养中的细胞活力和传播能力。A)大鼠ADSC的存活/死亡。B)hBMSC的存活/死亡。C)大鼠ADSC的F-肌动蛋白/ DAPI。D)hBMSC的F-肌动蛋白/ DAPI。

 

此外,研究人员测试了hBMSC的成骨分化和HUVEC的血管分化。与培养14天后的空白组相比,诱导的hBMSC显示出高碱性磷酸酶(ALP)表达,茜素红S(ARS)染色的钙结节也表明,包裹的hBMSCs实现了成骨分化。此外,包裹的HUVEC在细胞膜上显示了血小板内皮细胞粘附分子-1(CD31)的高表达,并显示了明显的细胞增殖。

 

图3 3D培养中的细胞分化。 A)hBMSC的ALP表达。 B)hBMSC的ARS染色。 C)HUVEC的CD31表达。 D)HUVEC的增殖

 

后续我们可以基于其他种类的水凝胶基底(例如胶原、明胶、透明质酸等)进一步构建3D细胞外基质。此外,固化环的基本材料可以转变为功能性材料,例如导电材料,高强度的一种或多种与生物因子和纳米颗粒混合的材料,以便对包裹的细胞增加额外的刺激。这一全新概念可以引领细胞培养和相关生物医学应用领域的趋势。

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如何解决 WB 非特异条带及高背景?问题排查+案例解析

如何解决 WB 非特异条带及高背景?问题排查+案例解析


Bio-Techne



生物学霸


前天

常有小伙伴抱怨:走过最长的路,就是 WB 实验的弯路。在上一期,我们的指南教大家如何应对常见的无条带或条带位置异常的问题。WB 实验时,还会遇到各种奇葩现象,比如非特异性条带和高背景,怎样才能获得背景干净的条带呢?这期我们继续来解疑。

非特异性条带,杂草丛生为哪般?

WB 显色后膜上有非特异条带或高背景是实验常见的问题,每一个实验细节可能会决定成败,例如抗体稀释液中 NaCl 成分和脱脂牛奶的比例就与非特异条带密切相关,下图的示例中,5% 脱脂奶粉和 0.5M NaCl 的体系下,非特异性条带更少。

利用 R&D Systems® 兔抗人 PTP1B 亲和纯化多克隆抗体(货号 AF1366)对 WB 实验进行优化。每个样本裂解 1×105 个细胞,并溶于 SDS 胶缓冲液进行 SDS-PAGE 蛋白分离:人 HeLa 细胞(Lane1)、MCF-7(Lane2)和 TF-1(Lane3)。电泳后,蛋白转膜至 Immobilon-P 膜,并在下述条件下免疫印迹,曝光时间为 30s。A,5% 脱脂奶粉封闭,一抗浓度:1.0 mg/mL,溶于 2% 脱脂奶粉和 0.15M NaCl;B,5% 脱脂奶粉封闭,一抗浓度:1.0 mg/mL,溶于 5% 脱脂奶粉和 0.15M NaCl;C,5% 脱脂奶粉封闭,一抗浓度:1.0 mg/mL,溶于 5% 脱脂奶粉和 0.5M NaCl。

除以上原因,其它与实验体系有关的原因及解决方法总结如下:

下面重点了解,与样品中目的蛋白特性有关的、需要考虑的因素:

比如目的蛋白表达水平低,为检测到目的条带,需要提高上样量,结果中易出现杂带。

以 PHD3 为例

其也被称为 Egl 9 homolog 3 (EGLN3),是一种广泛表达的脯氨酰羟化酶,理论分子量约为 27 kDa,它能羟基化靶蛋白如 HIF-1 alpha (Hypoxia-inducible factor) 上的脯氨酸残基。

在氧含量丰富的情况下,HIF-1 的 alpha 链会被 PHD 家族成员羟基化,从而导致其泛素化和降解。在低氧压力下,羟化反应减弱,HIF-1 alpha 亚基保留,HIF-1 得以入核,增加低氧相关基因的表达。

在典型的 HIF 信号通路中,PHD3 更多的影响 HIF-2 alpha。在大多数细胞类型中,HIF-2 alpha 受 PHD3 负调控,但有研究显示,在透明细胞性肾癌细胞 (ccRCC) 中 PHD3 高表达,并可维持 HIF-2 alpha 高表达。

所以,对于 PHD3、HIF-1 alpha 和 HIF-2 alpha 三种蛋白,通常在常氧条件下,在许多组织或细胞中表达量偏低,难以检测到,通常细胞需经过诱导后才可见表达量升高。如上图所示,使用 HIF-1 alpha Antibody (NB100-105) 检测由 CoCl2 诱导前和诱导后,Caki-1 细胞中 HIF-1 alpha 的表达。

使用 Novus Biologicals® 的 EGLN1/PHD2 Antibody (NB100-138) 和 EGLN3/PHD3 Antibody (NB100-139) 显示 HIF 羟化酶在原代大鼠肝细胞的细胞核和膜定位。以 COS-7 细胞核提取物作为对照,Normox:常氧条件,Hypox:缺氧条件,Reox:复氧条件 (图片来源:doi: 10.2353/ajpath.2006.060360)。

对此,针对 PHD3 的 WB 检测,有一些减少背景非特异条带的方法:

  • 降低上样量蛋白上样量过高,可能会导致高背景和非特异条带。

  • 建议不要使用 2% SDS(阴离子)裂解缓冲液处理样品。因为这种裂解液有时会导致抗体的背景升高。使用 NP-40 或 RIPA 最好。在 Novus 官网有裂解液中各种成分的说明,可以点击此处参考。另外,将样品在 95°C 下煮沸 5 分钟冷却后再上样更好。

  • 减少转膜时间(通常 90V/1h,甚至更少),因为较小的蛋白质(例如 PHD3)转膜速度会更快。

  • 将膜在室温下封闭 1 小时,洗膜 3 次,每次 5 分钟。封闭时间过长和过度洗涤会导致高本底并阻碍检测。

  • 用封闭液稀释一抗。前期验证发现 BSA 会引起该抗体产生高背景,所以我们建议使用封闭液 5% 脱脂牛奶稀释一抗。

  • 如果前期二抗工作浓度偏高,我们建议增加稀释比例,并只将二抗孵育 1 小时。设置去除一抗的对照实验以判断二抗的特异性。

值得注意的是,上表的因素中,由蛋白翻译后修饰(如糖基化等)、蛋白多亚型而出现的多条带,并不是非特异条带,需要根据文献及对照实验来多方面判断。

1. 由蛋白翻译后修饰造成的多条带现象

TREM2 (Triggering Receptor Expressed on Myeloid cells-2) 是一种细胞表面的受体糖蛋白,理论分子量约为 25 kDa。成熟 TREM2 包括一个 V-type Ig-like 胞外区域,一个跨膜区和一个短的胞质区。可溶形式的 TREM2 ECD 是由选择性剪接或蛋白水解产生,而细胞质区域可以通过酶裂解而释放。通过 Uniprot 数据库发现 TREM2 有 2 个糖基化位点,文献中 TREM2 呈现多条带且大于理论分子量,故推测为糖基化的 TREM2。

图片来源:Uniprot

WB 检测 THP-1 细胞裂解物中人 TREM2 的表达。用 0.2 μg/mL 山羊抗人 TREM2 抗原亲和纯化的多克隆抗体 (Human TREM2 Antibody,货号 AF1828) 和 HRP 标记的抗山羊 IgG 二抗 (货号 HAF109) 检测 PVDF 膜。在约 28 kDa 及以上的位置检测到多个条带(本实验在还原条件下,使用免疫印迹缓冲液 1 组)。

因此,如需在天然样品中检测未被糖基化的 TREM2,可尝试去糖基化实验,使用去糖基化试剂盒或使用 PNGase enzymes (Catalog # 9586-GH,9109-GH,7695-GHP)。后续排除非特异条带的干扰,可做只孵育二抗的阴性对照,更换封闭液(如将 BSA 换为脱脂牛奶),或者尝试 IP 实验。

2. 目的蛋白被酶切后产生不同亚型,造成多条带现象 

Brevican(也称为 BEHAB)是属于 lectican 家族的蛋白聚糖。Brevican 存在于中枢神经系统,由星形胶质细胞、少突胶质细胞和神经元表达。其中心 (GAG) 区域后端被截短,形成一个 GPI 锚定的剪接体。此外 Brevican 还可被多种蛋白酶水解,形成许多不同的短片段。如下图所示,在天然健康样品中可检测到两条带,推测为 Brevican 被蛋白酶裂解后的产物,约为 60 kD 和 90 kD。

WB 检测人小脑组织和人脑运动皮层组织的裂解物中 Brevican 的表达。用 0.1 µg/mL 绵羊抗人/大鼠 Brevican 多克隆抗体 (货号  AF4009) 和 HRP 标记的驴抗绵羊 IgG 多克隆抗体 (货号  HAF016) 检测 PVDF 膜。在大约 60 kDa 和 90 kDa 检测到 Brevican 的特异性条带(本实验在还原条件下,使用免疫印迹缓冲液组 1)。

高背景,条带去污小妙招

有时目的条带已隐约可见,但背景较深(如下图),这种情况虽也是实验操作或试剂造成,可能为膜的空白处与一抗或二抗结合、封闭剂未充分溶解、HRP 聚集等,但与非特异条带相比,容易改善,下面即为造成 WB 高背景的原因及改善方式。

又如:

1. 封闭时间不足

改善方式:增加封闭时间和/或温度,增加封闭剂的浓度(尝试增加至 10%),更改封闭剂(脱脂牛奶或 BSA),在抗体缓冲液中加入封闭剂(也可增加封闭剂浓度)。

2. 使用了错误的封闭剂

当检测磷酸化蛋白时,不推荐用脱脂牛奶作为封闭剂,因为牛奶和酪蛋白中富含磷酸化蛋白。

3. 抗体浓度偏高,导致非特异性结合

改善方式:降低一抗或二抗的浓度,在抗体缓冲液中加入封闭剂,做去除一抗的对照实验以判断二抗的特异性。

4. 清洗次数不足,非结合抗体未完全洗净

需要增加洗膜次数和/或洗膜时间。

5. 膜在实验过程中风干

确保膜在 WB 实验过程中不会变干。

6. 曝光时间过长

降低曝光时间,设置不同的检测时间点,逐步曝光。

7. 检测试剂太灵敏

在纯水中稀释检测试剂或使用灵敏度较低的检测试剂。

除此之外,对于 R&D Systems® 品牌验证过 WB 的抗体,通常会在产品页面给出检测体系建议,避免客户使用不合适的体系导致非特异条带和高背景。

Bio-Techne 旗下子品牌 R&D Systems® 和 Novus Biologicals® 拥有 10w+ 种一抗,在研发过程中,选择活性蛋白作为免疫原,经过严格的抗体验证。其中,经过基因敲除 (KO) 验证的 WB 抗体就将近 3000 种,极大地保障了抗体的特异性和实验的可重复性。

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比色的一些常谈

比色的一些常谈

原创 爱吃瓜的邵医森 邵医森 2月12日

比色是美学修复的基础

如果连比色都认怂做不好

那还谈神马美学哟!

先来看看教科书上关于比色的点

1、医师和技师之间应建立良好的交流。

2、诊室的环境应模拟白色自然光或者模拟日光条件;四周环境以灰色基调为好,不能有反光或颜色鲜艳物品。

3、去除干扰物,例如口红、闪亮耳环、围巾、眼镜。

4、在自然光线下比色,以上午10点至下午3点之间为最佳。

5、比色前清洁天然牙,去除邻牙烟斑、茶渍,必要时橡皮杯抛光。

6、比色时机适宜。在就诊开始时就进行;比色时间要短,前5秒第一印象很重要。

7、对于牙面尚完整或部分完整的牙,在预备之前进行比色。

8、比色前医师可先注视蓝色背景。

9、比色时医生应与牙面同一水平位置,比色者位于患者与光源之间。

10、对比色板稍稍湿润再进行比色效果更好。

11、根据邻牙、对侧同名牙和对颌牙,以及牙体预备前需要修复的患牙,进行分析,根据表面颜色特征比色,并且将患者的年龄、性别综合起来考虑,帮助患者得到颜色最协调合适的修复体。

12、选择亮度时环境光线不要过强,可半闭眼睛。

13、尖牙饱和度较高,可选尖牙作为色调的参考牙。

14、难以选到相似牙色时,选择最接近的低饱和度、高亮度的牙色,可以采用上色的方法弥补。

15、可使用排除法进行比色,逐渐排出与牙色不符的色卡(我不推荐)。

16、对于牙切缘、邻接面透明度的影响也需加以考虑,使用不同透明度的比色卡进行比色。

17、尽量分区比色,分为9分区,而不是3分区。

18、比色的同时,最好同期进行天然牙摄影以作为辅助手段观察牙颜色

形态及表面特征等。

——第7版人卫《口腔修复学》

接下来再细看看比色的一些知识

基础知识

1、初级色、次级色、补色

补色是当两种互补色等量混合后可形成灰色

补色的原理可用来改变修复体明度

例如A3含有橘红色调,可加入蓝色降低其明度

2、颜色空间

色调(hue):描述颜色、色彩

明度(value):色彩明暗程度

饱和度(chroma):色彩强度或饱和程度或纯度

透明度(pellucidity):光线穿透的程度

3、荧光、乳光、透光性

材料学家们极力模仿天然牙的荧光、乳光

合适的透光性使修复体更生动

乳光是指透光性材料在反射光下呈蓝色、

透射光下呈红-橙色

比色时的光源

专业的人造光是用5500K的颜色校正灯管

要求定期清理灯罩上灰尘和污渍

一般临床上用自然光,建议上午10时或下午2时

这里需要介绍一个概念:同色异谱现象

两个物体在同一个光源下颜色一致

在另一种光源下颜色不同

对于这类现象解决办法:

只有使得两个物体获得同一光谱曲线

临床上医生可以在不同光线下多次比色

材料上选择例如变色龙等材料

但是同色异谱现象无法杜绝

影响比色的因素

临床影响 临床应用
明度 与周围环境有关,“黑人的牙齿特别亮” 牙列和软组织颜色深会影响牙齿比色
色调 利用背景的补色使牙齿看起来更明显 比色时使用淡蓝色或者中性灰(18%)背景卡
饱和度 色调、饱和度与牙齿接近的背景使牙齿不明显 使用和牙齿颜色相关的低饱和度背景卡(灰色)使牙齿更浓
面积 牙齿越大显得越亮 可以通过调节亮度来帮助调整牙齿视觉上的大小
空间 外突的牙看起来更大 内收的牙可调亮,外突的牙调暗
连续性 快速在两种颜色间转换会有残留影响 在不同颜色的比色之间需要短暂休息

比色的步骤

以Vita 3D为例

第一步:透明度

第二步:明度(1-5)

将色调M、饱和度2取出比色

第三步:饱和度(1-3)

已选好的亮度+色调M取出比色

第四步:色调(L、M、R)

已选好的亮度+已选好的饱和度中选择

偏红(R)还是偏黄(L)

注意:

彩度较低(浅的颜色)同样明度下很难辨别色调

第五步:参考照片发送给技师

注意使用中性闪光灯(5500K色温)

比色照片、牙列照片、

病人面部照片、大笑照片

关于拍照的知识我还会再整理出一篇推文

使用不同的比色系统进行比色,减小误差

插入一段Vita 3D的比色视频

(感觉这段视频岁数比我都大,将就看吧)

可快进到7:56位置开始看

前面说的是一些颜色的基本知识

00:02 / 13:13

下载视频

高清

倍速

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树脂美学修复

四种分层概念:

基本层、经典层、现代层、流行层

树脂修复比色步骤

1、清理牙齿后选择牙本质饱和度(牙颈部位置)

2、选择釉质饱和度、半透明度

以上参考文献:《口腔美学比色》

临床上最常用树脂球比色法

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