为什么我的细胞研究结果和别人相反?

基因调控的方法不同,慢病毒,腺病毒,质粒,过表达或者敲除的方式都有所不同

基因组的整合或者非整合,瞬时表达和永久过表达也会造成结果不一样

有的基因有剂量效应,低,中,高的表达会引起表型的不同

生理情况下,长时间某个基因的过表达可能存在于部分细胞中,但是如果所有细胞都过表达,可能会造成不同的表型结果

四环素诱导的基因短时间过表达,也许能解决部分基因长时间过表达,表型不对的问题

上述称述没有查询相应的文献,纯属瞎想,得出于体外诱导细胞分化的一些实验。

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一文总结5分干湿结合生信套路+作者经验

一文总结5分干湿结合生信套路+作者经验

科研 话题的优秀回答者

今天要给大家拆解的文献是今年5月刚刚发表在Aging上的文章,影响因子5.515。

文章题目是Identification and validation of hub microRNAs dysregulated in esophageal squamous cellcarcinoma

从标题很容易看出本研究是常规的hub基因研究,但本研究之所以能发表在5分+上,我觉得一是文章研究的是microRNAs,有所新意;二是文章还做了点简单的实验对筛选出的两条microRNA进行了表型验证。

数据解构

挑——差异表达miRNA筛选

本文首先通过GEO数据库筛选食管癌差异表达microRNAs(miRNAs)。

作者选用了GSE114110和GSE43732两个数据集进行分析。值得一提的是,作者还利用R语言的limma包对数据集进行了标准化处理。作者设定的阈值为|log2FC|≥ 1和P < 0.05,由图E和F的火山图可以看出筛选出的差异表达miRNAs相比于平时我们筛选mRNA时是要相对少一些的。

作者使用的是limma包进行的差异表达分析,使用GEO数据库的在线工具GEO2R也能达到同样的目的。筛选到差异基因后,作者使用R语言VennDiagram包制作韦恩图,使用网站Draw Venn Diagrams (http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/Venn/)也可做出类似的图。最终筛选得到3个上调的和5个下调的miRNAs。

此外再提一句,在分析多个数据集时,可以将多个数据集的数据合并分析,但是必须得先去掉批次效应。如果不想去进行去批次的操作,可以像这篇文章这样采用取交集的方式,这样也算是有一定道理的。

联——miRNA靶基因预测

miRTarBase(http://mirtarbase.mbc.nctu.edu.tw/php/index.php)是一个经过实验验证的miRNA-靶基因相互作用数据库,作者利用这个数据库对8个差异表达的miRNA的靶基因进行了预测。3个上调的和5个下调的hub miRNAs总共分别预测出468和753个可能的靶基因。

除了miRTarBase网站外,常用的miRNA靶基因预测网站还有Targetscan、ENCORI、miRDB、miRWalk等。

圈——miRNA靶基因GO和KEGG富集分析

进一步地,作者对预测出468和753个可能的靶基因分别做了GO和KEGG富集分析。

本文中作者使用的是DAVID(https://david.ncifcrf.gov/) 网站,实际上GO和KEGG富集分析还可以用Metascape(https://metascape.org/gp/index.html#/main/step1)。

相比于DAVID,Metascape不但数据更新,还可以直接生成美观的图片。对于有R语言基础的小伙伴,还可以使用clusterProfiler包进行富集分析,并可利用ggplot2绘制气泡图。

联——PPI网络分析得到hub基因,miRNA-hub基因互作网络构建

作者又使用STRING数据库对预测出468和753个可能的靶基因分别作了蛋白蛋白互作(PPI)分析,并进一步地利用Cytoscape软件筛选得到hub基因各10个。然后对这20个基因做了GO和KEGG富集分析。本文作者将GO分析的三大类:生物过程(BP)、分子功能(MF)、细胞组分(CC)分开展示,并对靶基因、hub基因分别做富集分析,因此得到的图比较多。

随后,作者利用Cytoscape软件构建miRNA-hub基因网络。由于miR-196a-5p和miR-1-3p所关联的hub基因最多,作者进一步地利用miRNACancerMAP数据库分析了miR-196a-5p和miR-1-3p所涉及的信号通路。

miRNACancerMAP(http://cis.hku.hk/miRNACancerMAP/)是一个可以预测、构建癌症miRNA调节网络的在线工具,只需点击网站上方的Quick Search,输入想要研究的miRNA,即可得到分析结果。

靠——miRNAs预后价值分析

随后,作者利用利用TCGA数据库、细胞系以及临床样本验证了miR-196a-5p和 miR-1-3p的表达情况。并利用基于TCGA数据的starBase数据库对miR-196a-5p和miR-1-3p进行Kaplan-Meier生存分析,以评估其预后价值。

干湿结合

到这里其实这篇文章已经可以发表了,但最新的Aging已经不收纯生信文章了,要发5分必须补湿实验。

干湿结合的参考组合有:

1、生信+临床标本验证

2、生信+功能表型验证(细胞或者细胞+动物均可)

3、生信+临床+功能表型验证

4、生信+临床+功能+机制研究

这篇文章运用的是“生信+临床+功能表型验证”组合,作者做了一点实验来验证miR-196a-5p和miR-1-3p对食管癌细胞增殖和迁移的影响。所用实验为CCK-8、EdU和Transwell等常规实验技术,比较简单。这里作者只是用了miRNAmimics做实验,其实还可增加使用miRNA inhibitors的实验。

总结

到此全文就结束了,总结一下,作者先用GEO数据库筛选得到食管癌差异表达miRNAs(挑),然后利用筛选得到的8条miRNAs预测靶基因(联),并对靶基因进行富集分析(圈);进一步地在靶基因中筛选得到hub基因(联),并筛出两条与hub基因联系最多的miRNAs(联);最后对这两条miRNAs进行生存分析,来说明临床意义(靠),其实本文还可增加临床相关性分析,ROC曲线等分析进一步丰富内容。

此外,这篇文章还增加了一点湿实验的内容:利用细胞系和临床样本验证两条miRNA的表达情况(临床标本验证),并利用细胞实验验证其对食管癌细胞增殖迁移能力的影响(功能表型验证)。

整体来说,全文基本全部按照“挑、圈、联、靠”的生信套路来进行,所用技术以在线工具为主,适合初学者模仿。

最后再给大家归纳一下干湿结合研究套路模板(加粗的是本文所用的方法):

干:

挑:差异表达分析筛选目的基因

圈:GO/KEGG富集分析、GSEA富集分析、WGCNA网络分析、其他特殊分析(miRNA相关通路预测、免疫浸润等等)

联:蛋白蛋白互作(PPI)分析、miRNA交互作用、分子网络构建

靠:生存分析、临床相关系分析、单因素/多因素分析、差异表达预后分析、ROC曲线

湿:

1、临床标本验证(包括细胞系和临床样本)

2、功能表型验证(细胞或者细胞+动物均可)

3、临床+功能表型验证

4、临床+功能+机制研究

作者经验总结

关于生信文章的内在逻辑套路,酸菜老师已经用“挑圈联靠”四字箴言做了精妙的总结。对于本文“挑圈联靠”四个层面的解析,summer老师已经做了非常好的解读,不用我多说,建议大家先看完这一部分。做好这两步准备工作,咱们撸起袖子开聊。

返修文章的选题

首先我要感谢解螺旋《生信数据挖掘套路》这门课程。这门课程让我首次认识到生信文(套)章(路)的基本思路,让我理解了使用生信思维解决科研问题的基本框架。更值得一提的是,本课程适合没有任何R语言基础的小伙伴。你们可以在我的文章里看到大量借鉴课程中分析方法的地方。

大部分的生信文章,无论你做相对“低端”的hub基因还是相对“高端”的泛癌研究,都要挑选到合适的分子类型

这里面,我对大家的建议是,如果你有基础课题在研,那么请选择挖掘和你课题相同的分子类型。没有的话,当我没说哈。像我这样有基础研究课题(miRNA和食管鳞癌)在手的实验室顶级搬砖选手,我当然去选择挖掘食管鳞癌相关的miRNA数据。既然基础科研做的是食管鳞癌,那么肿瘤组织样本自然是有的,病理资料自然是统计的,miRNA逆转录好的cDNA自然是封印在冰箱里面等待我去召唤的。

关于最后的肿瘤功能学实验,其实完全可以同期去开展么,可能就是多加了几个实验组的事。即使不是同期实验,前面磨出来的实验经验也是文章顺利进行的保障。这都是非常省钱、省时间的策略。

目前,很多杂志都倾向于接受生信分析加实验验证的文章,补充的这些数据同样在文章返修的时候有着极大的助力,这点在后面会和大家分享。

数据集选择与整理

TCGA中食管癌的数据比较少,而且中国多发的食管癌类型是鳞癌。所以我选择了去GEO中挖掘食管鳞癌的数据集为文章的开端。当然数据集众多,最后能够完成数据处理,能够顺畅分析出合理结果的数据集组合其实是不多的。最后我选择了GSE114110和GSE43732这两个数据集来组合分析。

其实前期的芯片数据集的选择还是费了一些功夫的。所以,不是随便找两个芯片就是一篇文章,除非你运气好。不同平台的数据集进行交集分析,要想不被审稿人怼,要进行数据的标准化及差异分析后再取交集,或者去掉批次效应后合并分析,这些都是R语言的基础内容。本文中我采用取交集的方式。

利用各种在线数据库的相互验证

生信文章的展开过程,就是从一大堆分子中找到一小簇核心分子。你要证明寻找这一大堆分子的方法是正确的,还要证明这一小簇分子你是通过正确的手段找到的。以及后面要证明这一小簇分子是多么的重要(比如关联病人的预后),甚至在这小簇分子还要再做筛选。

后续验证的方法也需要通过多个数据库的相互佐证。这点肿瘤研究占有先天优势,因为TCGA和GEO衍生出来的二次分析数据库实在是太多了。这些二次分析工具的不断涌现也弥补了我们编程能力上的不足。所以,在一些工具没“死”之前,大家且用且珍惜,早发(灌)早完事。在靶基因的分析方面呢,可用的数据库如:Targetscan、miRTarBase、miRDB、miRWalk等,大家可以选择一个或者是多个数据库的预测结果取交集以增加结果的可靠性。

之后对靶基因的GO、Pathway分析的结果也验证了靶基因与肿瘤发展的极大关联性(因为富集到的通路都是和肿瘤进展显著相关的)。这样的结果就是在说,你看,我找的对,很合理的哇。

接下来我们,就分析出了miRNA靶基因中的hub基因了,同时对一小簇基因我们同样去进行了通路分析,结果表明与肿瘤进展明显相关。这样的结果还是在说,你看,我找的准,多合理呦。

接下来,顺理成章的构建miRNA-靶基因分子对。确定了核心中的核心miRNA:miR-196a-5p、miR-1-3p。除了他们能够结合最多的靶基因的理由之外,我还使用了miRNACancerMAP数据库进行分析。

miRNACancerMAP可以简单地分析miRNA的调节网络,类似于对miRNA做通路分析。结果证实了一些之前通路分析中涉及到的、肿瘤进展相关的重要的信号通路,例如MAPK、PI3K-AKT都与这两个miRNA相关联。这样的结果也是在说,你看,我找的妙,没问题呀。

后面就是常规的分子生物学、细胞生物学实验了,我也引用了点TCGA数据库里面的食管鳞癌数据进行佐证。

你们看,图6H显示miR-1-3p的生存分析没有意义。有点美中不足是不是?

不要慌,Pubmed上查一查,在讨论里面补充一下。这么好的分子,闭上眼睛都知道一定被研究得很彻底,轮不到我第一个吃螃蟹,最后我在讨论里面引用别人的文章来为自己背书。

总结和建议

1 总得来说,生信文章是要顺得下来的,每一步都要顺理成章。R语言分析的能力不足,那就用不同的在线数据库来为自己背书,多个数据库结果的相互佐证,能够极大地提高自己文章的可靠性。

2 你要问我怎么分析的这么顺畅,那是不顺的数据集被我放弃了,不然我不得发好几篇么。

3 还有我们可能遇到的情况是,可以用来分析的在线数据库众多,分析的结果有差异怎么办?比如数据库A、B、C的分析结果只有A的结果是我中意的怎么办?Follow Your Heart.生信文章,言之有理即可。那就跟数据库B、C说声:对不起,爱过。

4 最后我强烈建议各位小伙伴,有条件的情况下,尽可能的加入点分子生物学实验,最起码加入点样本验证。因为你加入的这些东西,可就是强有力的 “生信专家”嘴巴封堵器(大多数情况下)。基本上你在临床样本上验证出结果了,审稿专家一般不会对你的分析方法、算法什么的提出大的质疑,返修的时候会比较省心。

5 我是怎么知道这么多数据库,并且合理运用的?解螺旋生信全书听说过没?生信全书课程里面,先锋班优秀学员以及一些专业的生信老师针对常用的几十个数据库进行了少妇级别的详细介绍,强烈建议大家去听听,那样你就离5分文章不远了呦。

6 这条建议最重要:关于生信体系课的学习路径。参考小雪球老师在《应用数据库巧发SCI,再也不用满世界搜教程了》这篇推文中提到的,我这里搬运过来。

1. 对生信套路有个宏观认识:解螺旋免费课程中看-酸菜悟道生信–解构生信知识体系的顶层思维;

2. 学习拆解生信文章模块化套路规律:生信全书导学课;

3.从还原论的角度将一篇高分的零代码文章进行一一拆解:段位4 临床意义靠中零代码文章套路;

4. 按图索骥,用到啥学啥:把生信全书当作一部学习生信的字典,根据课程的介绍与说明,用到挑圈联靠四个模块中哪类工具,就学习哪类工具。

返修的爱恨情仇

当然,没有跟审稿人battle过的人生是不完整的。本文的发表也是一波三折的。

初次投稿后的一个月,我接到了第一次的审稿意见。果然,审稿人们没有对我的生信分析方法有任何的指导意见(文章毕竟有堵嘴神器)。但是其中的一个来自我国的审稿人(那英语味道太纯正了)比较认真负责,让我做深入的机制实验,另外要补充动物实验。Oh, my god,这也太丧心病狂了吧。当然了,我用着最狠的语气,说着最怂的话。其实怎么办呢,只能认怂叫dad,恭恭敬敬地按照他的意见对引言、讨论部分做了修改。

然而一个多月后我都没有收到任何意见。在和编辑沟通之后,我们确认这位专家跳票失联了。编辑自然是好编辑,本着一个专家不能少的原则,又为我量身寻觅了一位新的审稿专家,又送了我七条崭新的珍贵意见。同时这位专家对我按照第一条专家意见修改的部分内容提出了批判。我当时心里的情绪,不知道大家能不能体会。

最后在不断的修(ren)正(song)之后,文章终于被接受了,我终于长舒了一口气。不过在整个返修过程中,我的文章中没有补充任何数据,没有改过任何的图,都只是在文字上做修订。

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基础科研如何突破5分瓶颈?

基础科研如何突破5分瓶颈?

科研 话题的优秀回答者

学过《三十六策》的同学皆知晓,二元变量研究是基础研究中最基本的逻辑结构,而三元变量研究则是基于二元变量研究的升级版本。

在三元变量的逻辑论证结构中,主变量一般由分子承担,其下游效应因素多为通路或分子,而上游驱动因素则是分子或药物,其论证基本原则可总结为16个字:先辨主次、再分上下、两两调控、三三回复。

然而,原则简明扼要,学员们咂摸一番后却没有太多实感,所以今天分享一篇分子-分子-通路的三元变量一组交互文章(题目见下图),结合实际案例,手把手带大家领略三元变量组合研究的风采。

题目四要素

从题目提炼出的科学假设:在【结直肠癌】疾病中,主变量【Keratin 80】通过结合交互变量【PRKDC】上调效应通路【AKT pathway】介导【肿瘤侵袭、转移】表型。

主变量:Keratin 80

因变量:交互变量:PRKDC

效应通路:AKT pathway

表型:肿瘤侵袭转移表型、EMT表型(摘要部分有提到)

表型嵌套设计(因果嵌套):EMT表型介导了侵袭和转移表型

机制:

直接机制:Keratin 80与PRKDC直接作用(蛋白-蛋白交互模型)

间接机制:Keratin 80调控PRKDC;Keratin 80调控AKT pathway

数据解构

本文是一篇2018年发表在Cell Death & Disease上IF=5.959的蛋白-蛋白-通路三元变量一组交互设计模式的文章,文章主要包括生物信息学、细胞、组织三个维度,文章论证内容主要包括以下几个部分:

1、单变量表型论证

2、调控关系论证:主变量调控效应变量

3、主变量和交互变量的直接作用机制论证

4、调控关系论证:主变量调控交互变量

具体内容如下:

1、单变量表型论证

1)主变量的筛选:通过生物信息数据库-TCGA数据库、Oncomine数据库对Keratin家族进行筛选,发现主变量Keratin 80在CRC中高表达(Fig1);

2)表达差异:检测40对配对的CRC样本中主变量Keratin 80在癌组织和癌旁组织的mRNA表达情况,发现Keratin 80在CRC组织中高表达(Fig2A)(临床样本);

接着检测了癌和癌旁组织中主变量的蛋白表达情况(WB、IHC)以及临床样本生存分析,发现主变量具促癌的作用(Fig2B、C);

临床数据的展示方式:三表一图(table1-3,Fig2D、E)。

3)主变量调控侵袭、转移表型论证(细胞实验):首先检测了主变量在不同类型的CRC细胞中mRNA(Fig3A)和蛋白(Fig3D)表达情况,选择主变量高表达的两株细胞Caco-2和SW620细胞进行主变量敲减操作,选择主变量低表达的细胞株RKO做过表达操作(Fig3B、C、E)。

通过transwell实验观察双向操作主变量对于肿瘤侵袭和转移表型的调控情况;(Fig3F、G)

4)主变量调控EMT表型论证(细胞实验):免疫荧光染色(Fig4A)、细胞形态观察、EMT标志物检测(Fig4C)说明主变量可以调控EMT表型。

单变量论证部分总结:依照“表达差异、正反回复、细胞动物”的口诀,作者在这部分论证中缺少了单变量回复论证以及表型的体内(动物模型)论证的设计。

2、调控关系论证:主变量调控效应变量

1)主变量调控效应通路:过表达主变量后磷酸化的AKT蛋白表达上调(Fig4D)

这里效应通路介导EMT表型、EMT表型调控侵袭、转移表型均为已知内容,作者没有论证;

2)回复实验:主变量调节表型依赖于效应通路:过表达主变量同时加入AKT通路的抑制剂,观察EMT表型、观察侵袭转移表型(正正反)(Fig5)

作者通过回复实验建立了主变量、效应通路、EMT表型、侵袭、转移表型之间的连接,不足之处是:作者没有设计主变量经由嵌套表型来调控结局表型的回复实验。

3、主变量和交互变量的直接作用机制论证

作者通过内源性co-IP实验证明了主变量可以拉交互变量以及交互变量可以拉主变量(Fig6A),接着通过免疫荧光染色展示了主变量和交互变量在核膜处存在着共定位的情况(Fig6B)。

在直接机制这部分的论证中,交互变量的选取是通过co-IP+质谱鉴定的方式,选取的交互变量PRKDC是和效应通路AKT pathway具有已知调控关系的明星分子。

蛋白-蛋白交互直接作用,作者没有先通过外源性co-IP验证,而是直接做了内源性co-IP,虽然设计了双向互拉、亚细胞共定位,但是没有进一步进行分子分段来验证结合位点、位点突变、以及位点突变后的调控关系和功能验证,导致直接交互论证环节存在着很大的论证缺憾。

4、调控关系论证:主变量调控交互变量

1)通过WB结果展示了主变量对于交互变量的正向调控关系(Fig7A)

2)主变量调控效应通路、嵌套表型、结局表型依赖于交互变量的回复实验设计:过表达主变量同时抑制交互变量观察效应通路、嵌套表型、结局表型(正正反)(Fig7)

文章论证逻辑

1、Keratin 80主变量筛选及单变量表型论证(Fig1-3、Fig4A-C)

2、调控关系论证:Keratin 80调控AKT pathway及回复实验(Fig4D、Fig5)

3、调控关系论证:Keratin 80调控PRKDC及回复实验(Fig7)

4、蛋白-蛋白直接作用机制论证:Keratin 80结合PRKDC(Fig6)

(点击看大图)

文章套路及短板总结

1、本文是一篇三元变量一组交互+表型嵌套模式的文章,主变量和交互变量为蛋白-蛋白直接作用,交互变量下游调控的效应变量是一个通路介导表型的间接机制论证。

表型方面,作者设计了因果嵌套的模式,进一步增加了文章的层次,值得借鉴。三个变量+两个表型,文章整体框架显得很丰满。

2、变量选择方面:通过生信数据库预测筛选了主变量,通过co-IP+质谱鉴定的方法筛选了交互变量。

除了主变量承担文章的创新外,交互变量和效应变量以及表型之间调控的关系都是已知的,论证逻辑清晰。

但是在主变量的单变量表型论证方面,作者缺少了单变量回复论证以及表型的体内论证的设计。

3、调控关系方面:调控关系围绕主变量展开,主变量调控交互变量及回复设计,主变量调控效应变量及回复设计,作者都有论证。

但是在主变量介导表型嵌套的论证上,缺少了回复实验的设计,没能进一步突出主变量经由嵌套表型介导结局表型的因果嵌套的逻辑关系。

4、蛋白-蛋白直接作用方面:作者只进行了最基本的论证——内源性co-IP互拉+亚细胞共定位,没有进一步做作用位点验证、位点突变结合论证、以及突变后调控关系和表型论证。

交互模块论证的三个层次,作者只论证了第一层次,这也是本文最突出的短板,也决定了文章的档次只能在5分多一点的水平。

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Measure

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lncRNA数据库——Lnc2Cancer v2.0

lncRNA数据库——Lnc2Cancer v2.0

科研 话题的优秀回答者

随着新热点的出现,lncRNA在肿瘤中的研究看上去没那么火了,但2019年发文量却再创新高,达到了3252篇。相信正在做lncRNA的同学依然还有很多,在这个过程中如果你有这些需求:

想知道这个lncRNA有没有人做过?

这个lncRNA在哪些肿瘤里被研究过?

在细胞或组织中被验证过?

关于这个lncRNA有没有测序数据?

这个lncRNA有哪些表型?

关于lncRNA和表型有哪些实验可以进行?

这个数据库就能帮到你。

今天介绍的是由哈尔滨医科大学李霞教授组开发的Lnc2Cancer v2.0数据库,网址:http://www.bio-bigdata.net/lnc2cancer,相关文章发表在国际知名期刊Nucleic Acids Research上面。(PS:如果想知道lncRNA与哪些基因有interaction等等,那就看我们之前介绍过的starbase数据库,也很棒的数据库)

网站的主页长这个样子,在红色的框框里,大家可以直接搜索lncRNA或者癌种,也可以在箭头指的地方进入网站的1.0版本。

在底下有7个图片,表示Lnc2Cancer v2.0的7个重要功能。

分别是人类肿瘤中的循环lncRNA(液体活检也是热点哦);

肿瘤中的抗药性相关lncRNA;

肿瘤中能预测病人预后的lncRNA;

肿瘤中被miRNA调节的lncRNA;

肿瘤中被变异调节的lncRNA;

肿瘤中被转录因子调节的lncRNA;

肿瘤中被甲基化调节的lncRNA。

所以筛选到一个lncRNA,如果你不知道怎么动手,来这个网站逛一逛说不定就能找到合适的方向和灵感了。

点击7个模块中的任何一个,出现的结果界面都长下面这个样子,可以看到lncRNA和肿瘤名称,研究所采用的方法,表达模式是上调还是下调,是否与抗药有关,是否在循环中出现,以及是否能预测病人预后,还有文献来源。

点击details进去可以查看更多内容,如功能,样本或者细胞系,功能描述等。

上面黄色条带中的红色方框的部分可以帮助大家定位或筛选lncRNA。比如lncRNA centric部分,可以直接筛选,也可以只看有实验验证的某部分,帮助你快速找到相关的lncRNA和文献。

Cancer Centric部分可以选择自己研究的癌种,这里的癌种数目就很多了,共有165个癌种。

高级搜索部分可以帮助大家多条件筛选,比如下图中,我选的是肝癌中那些能预测病人预后,机制为miRNA调节,且被RNA-Seq等多种方法在组织和细胞中验证了的lncRNA。然后还真找到了一条,点击进去看了下,文章发表在了影响因子10分多的Molecular cancer

如果你想自己找一些lncRNA的测序或者芯片数据集,也可以点击顶头的“HIGH-THROUGHPUT EXPERIMENT”查看,网站记录了数据的相关信息,如样本数等等。

如果你想知道这个lncRNA研究得多不多,可以点击顶头的“LNCRNA-CANCER SCORE”,然后会出现如下列表,score越高,表示被研究得越多。

当然,如果你想下载这个数据库的数据自己回去倒腾也是可以的,点击顶头的“DOWNLOAD”就可以了。

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专访陈列平教授:说到免疫治疗,我有些不同看法

专访陈列平教授:说到免疫治疗,我有些不同看法

陈老师的思路值得学习。

已认证的官方帐号

陈列平教授是全球免疫疗法当之无愧的先驱,在人类的抗癌史上谱下了多段华章:上世纪90年代,他的团队率先发现了B7-H1(后被称为PD-L1)分子,并证明它在肿瘤免疫逃逸过程中扮演了重要角色;2002年,他的团队又发现通过抑制PD-1与PD-L1的结合,能够增强免疫系统的抗肿瘤能力。这些突破性的贡献直接推动了抗PD-1/PD-L1免疫疗法的开发,彻底改变了癌症的治疗格局。

多款重磅免疫疗法问世之下,业内正尝试不同的免疫疗法组合,以求带来全新的治疗方案。有趣的是,面对这一研发热潮,陈列平教授却坦言“路有些走偏”。在他看来,许多组合并没有科学依据,甚至可以说是在“碰运气”。

“很多根本的科学问题都还没有得到解决,大家就急着涌入临床治疗中去,这是目前的最大问题,” 在药明康德内容团队的专访中,陈列平教授这样说道:“现在的免疫疗法领域有一个不好的趋势,就是大家不愿意讲一些和主流不一样的东西,但我还是想讲讲自己的一些不同看法。”

免疫疗法的序章

使用免疫系统对抗癌症,并不是最近才诞生的新概念。早在100多年前,威廉·科莱(William Coley)医生就曾对癌症患者注射细菌或细菌产物,以求增强免疫系统的活性,治疗癌症。一些资料表明,在他40年的行医生涯里,曾对1000多名癌症患者进行过类似的治疗。在很小一部分患者中,也的确能观察到肿瘤尺寸的缩小,但是治疗带来的毒性,使得治疗无法继续下去。

▲现代不少科学家认为威廉·科莱医生是免疫疗法最早的开拓者之一(图片来源:[CC BY 4.0 ], via Wikimedia Commons)

这可以说是早期癌症免疫疗法的一个缩影:基于“免疫反应不足以抑制肿瘤生长”这一假设,科学家们专注于增强或放大机体全身的免疫反应,让免疫系统对癌症发起攻击。基于这些策略,在过去的几十年里,干扰素、白介素2、抗CTLA-4抗体以及最近新兴的CAR-T细胞治疗,也陆续得到了美国FDA的批准,用于治疗黑色素瘤,肾癌以及一些血液肿瘤等特定的癌症。

但在将上述免疫疗法用于治疗肺癌、乳腺癌、肝癌等临床常见的实体瘤,所有临床试验都以失败告终。“尽管这些疗法都能看到免疫反应的增强,比如T细胞的增多,但在大多病人身上,这些增强的免疫反应和临床效果没有关系,病人的肿瘤照样长,”陈列平教授说道:“所以当时很多人认为免疫系统对治疗癌症没什么用,不少人也撤出了这个领域。我们这批留下来研究免疫疗法的人都是‘死硬分子’。”

▲FDA批准的癌症免疫疗法以及它们的适应症(数据来源:参考资料[1];制图:药明康德内容团队)

因为相信,所以看见。当时的一些探索者们清楚地看到了“免疫增强型”疗法存在的一些问题——它们只是系统性地增强免疫系统活性,甚至将原本“正常”的活性提高到了“异常”的水平,却不能特异针对肿瘤生长过程中的免疫缺陷。“如果免疫系统和T细胞的激活没有问题,那问题可能出在最后一步,T细胞进不到肿瘤里。所以我们才开始从肿瘤微环境中寻找解决思路。”陈列平教授回忆说。

PD-1/PD-L1通路与组合疗法

如今我们知道,肿瘤之所以能逃脱免疫系统的攻击,一大原因在于肿瘤演化出的多种免疫逃逸机制。在这些逃逸机制的作用下,T细胞的活性会在肿瘤微环境中得到抑制,使肿瘤逃过免疫系统的攻击。

PD-1/PD-L1通路的发现,以及多款抗PD-1/PD-L1重磅疗法的横空出世,重新定义了癌症的治疗格局。由于直击肿瘤的免疫逃逸机制,与“免疫增强型”疗法相比,这类疗法“能够以很高的有效比例治疗广谱肿瘤,而且毒性非常低。”陈列平教授指出,抗PD-1/PD-L1抗体代表了一类全新的免疫疗法——它们不再简单“增强”免疫反应,而是让肿瘤发病过程中出现缺陷的免疫系统“恢复正常”。

▲“免疫增强型”疗法与“免疫正常化”疗法的示意图(数据来源:参考资料[1];制图:药明康德内容团队)

这些疗法在临床上取得了巨大成功,也催生了大量组合疗法的研发。但免疫疗法领域的这一发展趋势,却有些出乎陈列平教授的预料——“几年前我预计说,肿瘤微环境中还有那么多的靶点没有发现,无论是公司还是投资者,如果能大规模投入其中,把微环境中的问题搞清楚,免疫疗法一定会有大发展。但现在看起来,大的方向有一点偏,不大像我预测的方向。”

陈列平教授分享说,目前研究免疫组合疗法的临床试验在美国已经超过了2000个,其中90%以上都是研究PD-1/PD-L1与其他疗法的组合。“这也可以理解是比较快速的一条路,但把现有的疗法与抗PD-1疗法结合一下,基本上都是随机的组合,没有太多科学依据在里头。”当然,偶尔一些组合疗法能取得较好的治疗效果,今年4月获批的Keytruda与Inlyta组合(靶向PD-1与VEGFR)就是一个例子。“但疗效之外,我们依然学不到多少东西。”

“从历史上看,抗PD-1/PD-L1抗体的治疗效果和其他疗法大不一样,趋势还是挺明显的。很重要的一点是我们已经知道为什么不一样。知道为什么有效,才能学到东西,”陈列平教授说道:“我还是相信要解决最基本的科学问题。大部分肿瘤目前还不能被有效控制。如果不能从组合疗法中学到新东西,我们的进展就不会很快。

序章的终结

去年10月,陈列平教授团队在顶尖学术期刊《细胞》上发表前瞻性评述(perspective),总结了他对免疫疗法过去数十年来发展的思考。在他看来,我们需要更多让免疫系统“恢复正常”的疗法,这是治疗更多癌症所需的范式改变,也意味着免疫疗法将终结序章,走向成熟。

▲陈列平教授团队在《细胞》上刊文指出,免疫疗法的范式需要改变(图片来源:参考资料[1])

专访中,陈列平教授向药明康德内容团队介绍了研发这些 “免疫正常化”疗法的三个原则——“第一点,我们要知道免疫缺陷是否是肿瘤引起的。而这些机制不是正常免疫系统需要的,因为这样才会给将来肿瘤治疗带来选择性。” 举例来说,CTLA-4并非是肿瘤特异利用,而是整个正常免疫系统都需要的分子。一旦把它去掉,正常免疫系统就会出现异常。“CTLA-4这个靶点用于治疗黑色素瘤有作用,但并没有让我们学到很多新东西,更多的还是以前‘增强免疫’的概念”。

这一点容易理解,研究起来却有一定难度。陈列平教授指出,由于进入新药临床试验的大多是晚期病人,疾病已经存在多年,常常经过了多种不同的治疗,因此癌症或者免疫系统本身,或多或少都有些“人为引起的变异”,病人之间的异质性非常大。因此,一定要对病人群体进行细分,选择性地寻找其中的关键分子。

“第二点,这些免疫缺陷(分子)需要集中在肿瘤微环境中,而在正常组织中完全或几乎没有。”陈列平教授说:“我们需要找到肿瘤特异或是高度选择性表达的分子。这样就算新药治疗中发生不可预测的副作用,它们也集中发生在肿瘤微环境。”

“第三点,新的靶点需要是一个主要的功能通路。这也是更难一些的要求。我们观察到在肿瘤里面,有很多通路可以共存。怎么找到一个能够调节整个微环境的主要通路?”陈列平教授介绍说,他的团队目前开发了一种新的系统,能将病人的肿瘤组织移植到具有免疫缺陷的小鼠身上。这等于是将微环境孤立出来,然后特异性地用药物去做调控,寻找其中的关键通路。这能避免系统性免疫增强干扰对实验结果的影响,也能让研究人员们对药物的评估结果更具信心。

“这三条在我看来,只是最低要求,”陈列平教授说道:“在这个基础之上,针对不同靶点的作用机制,增加新的标准,才能找到最好的靶点。”

寻找新的靶点

根据患者体内PD-L1水平的高低,以及肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)的多寡,陈列平教授团队将肿瘤病患分为四类。其中TIL较多的患者群体是研究人员们的侧重点。“这些患者体内的T细胞已经进到肿瘤部位了,目标比较明确。之所以T细胞不起作用,说明微环境里肯定有其他分子,光抑制PD-L1还不够。”陈列平教授解释道。

▲TIL较多的患者是研究人员们的侧重点(数据来源:参考资料[1];制图:药明康德内容团队)

为了寻找潜在的免疫疗法新靶点,陈列平教授团队开发了一个筛选平台,其中包含了超过95%的人类膜蛋白。利用这一平台,研究人员们能够找到一些可能影响免疫功能的分子,再回到肿瘤类型中做比对,寻找这些分子在肿瘤中是否有特异性的变化。利用这一平台,这支团队找到了多个潜在的新靶点。今年1月正式发表于《细胞》杂志上的LAG-3配体FGL1,就是最新的一个案例。

找到靶点后,研究人员们思考的,便是如何进行快速的转化,将最新科学发现转变为造福患者的创新疗法。“我们其实找到了很多潜在靶点。在选择靶点进入临床试验前,我们根据常见的实体肿瘤,列了一张表格。根据病理学分析,我们尽量选择涵盖较多肿瘤类型的靶点进入临床,”陈列平教授介绍道:“这样的疗法也能帮到更多的患者。”

NextCure

在临床转化的过程中,曾启动并参与组织抗PD-1/PD-L1抗体首个人体试验的陈列平教授也在不断总结过去的经验与教训。“在做完PD-1/PD-L1通路的研究后,我们也曾检讨和反思,为什么科学研究要等上十多年才上临床,我们能不能做得更好?”

反思找到的问题,是学术界与产业界之间所存在的一道鸿沟。“学术界有这么一个现象,就是研究出一个东西来,需要写成文章,经过同行评议,然后再发表。如果一家公司对你的研究感兴趣,再和学校协商引进专利授权,这个过程可能要3-5年。”陈列平教授说道。

而解决这个问题的答案,则是一家名为NextCure的生物技术公司。“这个名字是我起的,可以看出当时很有信心。当时我们觉得在抗PD-1/PD-L1疗法之后,还能治愈更多的癌症,”陈列平教授笑着说道:“创立NextCure的想法,就是把这几年的时间省下来。”

自建立之初,NextCure团队就与陈列平教授团队保持着紧密联系。每当找到一个潜在靶点,科学家与研发人员就会根据主要数据进行讨论,决定是否要继续推进。“我们当时的想法是,一旦发现潜在靶点和基本原理,就能在发表论文前推进到临床试验。我们可以同时做,不能等到论文发表之后再做。

NextCure的领先在研疗法NC318(一款“first-in-class”的Siglec-15抑制剂)就在这一模式下,快速推进到了临床阶段。“我们临床试验去年10月开始,当时论文在审稿阶段,还没有发表。到了今年2月论文在线发表时,我们的1期临床已经进行一半了,”陈列平教授和我们分享道:“如果按传统方法,在论文发表后还要再和公司协商转让, 然后验证结果, 生产药物等等。不知道还需要多久。”

▲本研究正式发表时,1期临床试验已经进行过半(图片来源:参考资料[2])

时间上看,从发现靶点起,NextCure就在筹划抗体的生产,以及临床试验的准备。与此同时,研究人员们还在不断完善科学细节,准备论文的发表。“有时这些数据不是临床试验所必需的,却是发表论文所必需的,是锦上添花的工作,但并不影响主要结论。”陈列平教授说道。通过齐头并进,据估计,NC318在临床推进上,省下的时间比传统方法至少要超过3年。

新型免疫疗法的曙光

目前,NC318正在1/2期临床快速推进,预计8月前能结束1期临床试验的阶段,而2期临床设计也接近完成。在剂量爬坡试验中,研究人员们并没有观察到明显毒性,这也符合试验的预期。“如果只是集中于肿瘤部位,调控微环境的‘主要开关’,我们本来也预期它没有多少毒性。证实这一点,让我们感到非常振奋。”陈列平教授说道。由于作用部位高度特异,“低毒性”或许正是“免疫正常化”疗法的一个特性。

根据公开信息,一名先前对PD-1/PD-L1治疗产生耐药的肺癌患者,已在NC318的治疗后出现了部分缓解。考虑到1期试验部分的终点是安全性和耐受性,陈列平教授认为目前的数据表明,这算是一个非常成功的1期临床试验。“要知道这还只是1期临床试验,还在做剂量爬坡。前面的很多剂量还很低,可能不是用于治疗的最佳剂量。但我们不光得到了安全性和耐受性数据,还见到了一些缓解病例。当然,这些还需要在2期临床试验中做验证。”

▲NextCure的在研管线一览(图片来源:NextCure官方网站)

值得一提的是,与PD-1/PD-L1通路尽量减少重叠,正是NextCure选择靶点中的优先考量。因此他们在临床试验中所接受的患者,要么是PD-L1表达水平较低,不符合其他临床试验的需求;要么是已经经过了抗PD-1/PD-L1疗法的治疗,疾病却依旧出现进展。这些患者,也正是最需要创新疗法的人群。

不过陈列平教授也指出,癌症免疫疗法并不是万能药。考虑到晚期肿瘤的高度异质性,每一款创新免疫疗法,所能治疗的也只是一部分患者。“目前看,NC318与抗PD-1疗法适用的患者群体可能差不多大。比如黑色素瘤里有20-30%的患者可能生效,肺癌里也差不多。”

5-10年内搞清癌症

聊到对癌症免疫疗法的专注与热情,陈列平教授提到了他最初当医生的经历。“我做过很短一段时间的医生。当时我在肿瘤科,但上个世纪80年代的肿瘤科很惨,连化疗药都只有很少的几种,所以每个病人进病房都很清楚自己必死无疑。我们只是让这些病人多活几个月,而且这几个月生命的代价还很大,因为药物的毒性很大,”陈列平教授回忆说:“我天天看到这样的情况,但什么都做不了,然后看着病人去世,这是一个很难受的工作。”也正因为此,陈列平教授辞去了医生的工作,考到了协和医学院做研究生。而在“预防”与“治疗”两大方向之间,他挑选了离临床转化比较接近,“这辈子还能看到疗法问世”的免疫学。

30多年的耕耘后,这名曾经的肿瘤科医生,已经成为了全球癌症免疫疗法的领军人物。当问及免疫疗法何时能攻克癌症,陈列平教授指出业界不宜操之过急。即便是抗生素这样存在那么久的药物,也只能控制绝大多数的感染。对于癌症治疗,我们同样不能要求100%治愈。

“现在的抗PD-1/PD-L1疗法下,很多患者可以长期得到部分缓解。他们的肿瘤还在,但很稳定,或者正在慢慢缩小,可以活很长时间。如果能达成这个目的也不错,”陈列平教授说道:“晚期肿瘤的异质性太大。如果有像PD-1/PD-L1这样的主要通路,能再找到3到4条,控制或者治好70%-80%的肿瘤,实际上就已经很成功了,这个目标是可以达到的。

“以这个目标来说,应该不会太久。现在我们已经很清楚肿瘤微环境是一个主要的靶向部位,所以我们至少知道应该去哪里找东西。当然临床试验进展可能比较慢一些,但我觉得未来5-10年里,应该能把这些主要的通路搞清楚,”陈列平教授补充道:“我对此还是很乐观的。当然,实现这一目标前,我们还有大量的工作要做。”

参考资料:

[1] Miguel F. Sanmamed and Lieping Chen, (2018), A Paradigm Shift in Cancer Immunotherapy: From Enhancement to Normalization, Cell, DOI:https://doi.org/10.1016/j.cell.2018.09.035

[2] Jun Wang et al., (2019), Siglec-15 as an immune suppressor and potential target for normalization cancer immunotherapy, Nature Medicine, DOI: https://doi.org/10.1038/s41591-019-0374-x

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G418筛选稳定表达细胞系 方法





2007-4-24 22:04:46

G418筛选稳定表达细胞系


wanglaow…

原理

分析转化的功能和表达需要DNA稳定转染至宿主细胞染色体。外源基因进入细胞后,部分能够通过细胞质进入细胞核内,根据细胞类型,至多80%的进入核内的外源DNA得到瞬时表达。极少数情况下,进入细胞的外源DNA通过系列非同源性分子间重组核连接,形成巨大的***结构最终整合进细胞染色体。细胞基因组自由部分表达,所以整合并不一定意味着表达,只有整合到表达区的基因才会表达,而且整合到不同的染色体区段的外源基因的表达的量也是不同的。由于摄取、整合、表达外源基因是小概率事件,通常根据新表型筛选稳定转染体。一般情况下这种新表型由共转染的编码抗生素抗性基因提供。细菌Tn5转座子序列(neo抗性基因)携带的氨基糖苷磷酸转移酶可以将G418转变成无毒形式。G418是一种氨基糖类抗生素,其结构与新霉素、庆大霉素、卡那霉素相似,它通过影响80S核糖体功能而阻断蛋白质合成,对原核和真核等细胞都有毒性 ,包括细菌、酵母、植物和哺乳动物细胞 ,也包括原生动物和蠕虫。是稳定转染最常用的选择试剂。当neo基因被整合进真核细胞基因组合适的地方后 ,则能启动neo基因编码的序列转录为mRNA,从而获得抗性产物氨基糖苷磷酸转移酶的高效表达 ,使细胞获得抗性而能在含有G418的选择性培养基中生长。G418的这一选择特性 ,已在基因转移、基因敲除、抗性筛选以及转基因动物等方面得以广泛应用。

在进行转染时细胞膜受到影响,抗生素可能对细胞产生较大影响,加上G418有杀菌作用,所以有人主张转让时不加其它抗生素。其实G418本身有很好的杀菌效果,在用G418进行筛选的过程中很少会发生污染。但有一点,其实我觉得问题也不是很大,那就是:在老外的一本实验手册中提到,在脂质体转染时所用培养基中最好不加任何抗生素。我想他的想法可能是脂质体对细胞膜有影响,可能此时加抗生素对细胞损伤较大。因为庆大霉素、链霉素、G418均是氨基糖甙类药物,其药理作用完全一样。所以没有必要再用,而且由于另外抗生素的添加实际增加氨基糖甙类药物的浓度,剂量有误差,不利于各实验室之间的交流,在实际操作中,培养液中有抗生素对细胞培养与筛选影响不大。

有人认为用磷酸钙共沉淀转染法筛选稳定整合子较好,但这种观点是很多年以前的观点了,而且只是少数人的观点。我两种方法都用过,但没有特异的比较过,感觉都可以。磷酸钙便宜,但对溶液配置和实验操作要求很高,尤其是溶液的PH值,要求精确到小数点后2位。脂质体是现在主流的转染试剂,从没有人说这种方法做整合稳定表达不行。非脂质体是这几年发展很快的技术,转染效率低,细胞毒性小,价格也不贵,Qiagen就有一个系列。我个人觉得不必要花太多时间在这方面,自己实验室用得好的技术可以坚持,没有经验的可以选择一个较著名的公司的产品开始,购买之前先下载个说明书看看。有精力就比较一下几种方法,一般的用达到目的就行了。关键是实验设计。

G418和筛选

筛选之前

由于每种细胞对G418的敏感性不同,而且不同的厂家生产的相同浓度的G418的活性不尽相同,所以在筛选之前,一定要确定G418的最佳筛选浓度。具体如下:将细胞稀释到1000个细胞/mL,在100ug/mL~1mg/mLG418浓度范围内进行筛选,选择出在10~14天内使细胞全部死亡的最低G418浓度来进行下一步的筛选试验。

由于每种细胞对G418的敏感性不同,一般变动在100ug/ml1000ug/ml范围。而且不同的厂家生产的相同浓度的G418的活性不尽相同,所以在筛选之前,一定要确定你的细胞对这一批G418的最佳筛选浓度。尽管如此,特性明确的细胞系G418的最佳用量还是稳定的。《分子克隆》给出了几个常用细胞系所需G418的最佳用量。

细胞系或机体
 G418浓度(ug/ml
中国仓鼠卵巢细胞
700800
Madin-Darby犬肾细胞
500
人上皮A431细胞
400
CV-1细胞
500
盘基网柄菌属
1035
植物
10
125500

看下面的一个试验:3×106个细胞电转后,分别接种1/40001/10001/300细胞到24孔板中,48 h后加药筛选,此时1/300细胞孔内大约50%汇合度。理论上1/4000孔内应有4%的汇合度。筛选9天后,观察1/4000孔内有两三个克隆,按比例1/300孔内应该有几十个克隆,事实上,它们几乎全死光了,只有几个克隆。所以汇合度对G418筛选结果的影响很大,一般筛选时汇合度不宜超过50%

加药时间

由于基因转染到细胞内之后要一段时间才能表达出蛋白质。所以筛选不能太早;但是也不能太晚,因为转染了外源基因的细胞代谢负荷较大,增值较慢,时间长了就会被没有外源基因转入的细胞所淹没,最终导致筛选不出阳性克隆,一般要在转染24小时之后才开始加G418筛选。随着细胞的代谢G418的浓度和活性都回下降,所以每3~5天都要更换一次含有G418的筛选液。这时药物浓度可以降至200ug/ml

培养液

加药筛选约6天左右,细胞会大量死亡,孔中只剩下的细胞寥寥无几。这时会出现两个问题:1.死亡的细胞会裂解释放出有害物质,导致那些有neo表达的阳性细胞死亡,即非选择性死亡。2.孔中细胞数目很少,细胞之间的信号会变得很弱,也会导致阳性细胞的状态不佳甚至死亡。这个时候需要一种特殊的培养液:假如你要转染3T3细胞,在3T3细胞汇合度达到80%的时候,换液,培养过夜之后收集培养液,通过滤器消毒,和新鲜的培养液按11混合备用。再转染后筛选过程中就可以应用这种培养基。

挑选单克隆的优化

为了尽量减少阴性克隆的死亡给阳性克隆造成的不利影响以及增加阳性克隆的得率,可以应用套环法或刮除法结合有限稀释法来筛选阳性克隆。加药后,在高倍镜下,阳性克隆和阴性克隆很容易辨认,在阳性克隆下用记号笔做个标记。然后刮除隐性克隆,消化阳性克隆后继续筛选培养;或则用套环套住阳性克隆,在套环内加胰蛋白酶或EDTA消化,把消化液吸到另外一个新的孔中培养。最后再用有限稀释法把阳性克隆在96孔板中筛选。

鉴定之后

一般经过4周左右的筛选,得到的阳性克隆都比较稳定。但是外源基因如果没有整合到基因组中的话,目的基因还是很容易丢失的。但是外源基因整合到基因组中的概率太小了,而且是随机整合,会导致表达的目的蛋白的量产生很大差异。随着培养时间的延续,那些丢失了外源基因的细胞和很少表达目的基因的细胞会占据优势,强表达目的蛋白的细胞会越来越少。这样再次筛选是必不可少的。只有经过2次以上的筛选之后才能找到那种我们想要的强分泌目的蛋白的,遗传稳定的细胞克隆。

Protocal

1.G418的配制: 1g G418溶于1ml 1MHEPES液中,加蒸馏水至10ml,过滤消毒,4度保存。

2.细胞培养:取待测培养细胞,制备成细胞悬液,按等量接种入多孔培养板中,培养6小时左右开始加药。

3.制备筛选培养基:在100ug/ml1000ug/ml范围内确定几个梯度,比如先做个100ug/ml400ug/ml800ug/ml1000ug/ml,按梯度浓度用培养基稀释G418制成筛选培养基。

4.G418筛选: 吸除培养孔中培养基,PBS洗涤一次,每孔中加入不同浓度的筛选培养基。

5.换液:根据培养基的颜色和细胞生长情况,每3~5天更换一次筛选培养基。方法同4

6.确定最佳筛选浓度:在筛选1014天内能够杀死所有细胞的最小G418浓度即为最佳筛选浓度。在第一轮就筛选出最佳G418浓度的可能性不大,最有可能的是出现这种情况:用某一浓度G418的量在筛选14天后还不能杀死细胞,而用下一个梯度的 G418的量在10天前就看不到活细胞了。假如是400ug/ml不能杀死细胞,而800ug/ml在第5天就把所有细胞都杀死了,则可以再用500ug/ml600ug/ml700ug/ml进一步筛选,以确定最佳筛选浓度!心得:由于特性明确的细胞系G418的最佳用量还是比较稳定的,所以有时候不需要在这么大范围内进行筛选。比如说你要转染NIH3T3细胞 ,现在我告诉你我测试过NIH3T3细胞对G418的敏感性,我用的筛选浓度是200 ug/ml。这时你就可以做150ug/ml200ug/ml 300ug/ml三个浓度进行筛选。

通过预实验确定了最佳筛选浓度后,就可以做稳定转染了。

a 转染:转染后培养24小时或者更长,到细胞增长接近汇合时按14密度传代,继续培养,待细胞密度增至50%~70%汇合时;

b G418:去掉培养液,PBS洗一次,加入按最佳筛选浓度配制好的G418筛选培养基。

c 换液:根据培养基的颜色和细胞生长情况,每3~5天更换一次筛选培养基。当有大量细胞死亡时,可以把G418浓度减半维持筛选。 筛选1014天后,可见有抗性的克隆出现,停药培养,待其逐渐增大后;

d 挑单克隆:制备细胞悬液,细胞计数,用培养基稀释细胞到1/10ul。在96孔板中加入培养基150ul/孔,再加入细胞悬液10ul/孔。待其逐渐增大后转入到48孔中增殖。

e 单克隆鉴定:细胞大量扩增后,提取总RNA,做RT-PCR检测目的基因是否存在。

常见问题:

1.转进去的重组质粒以什么形式存在于细胞内的?

无怪乎两种形式:整合在染色体中和存在于细胞质中。没有经过筛选前大部分转染进细胞的质粒是存在于胞质中的,但是这种质粒是不稳定的,基本上筛选不出这种单克隆,只有稳定整合入染色体的才是我们想要的稳定细胞系。

2.neo基因和目的基因是不是一定会整合在一起?

整合是随机发生的非同源性重组,neo基因表达而目的基因不一定都表达,所以在筛选之后还要用RT-PCR的方法进一步鉴定。

培养基处理的个人技巧

体内的任何细胞被置于体外培养后,对环境都有一个适应过程,期间细胞对培养液具有同化作用,即细胞从培养液中摄取营养的同时,也向培养液排出自己的代谢产物和其它一些物质,其中有排泄物也有促细胞生长因子。这个过程也是细胞同化培养基的过程。细胞越多则其同化作用越强,所以细胞数目多比数目少较易生长。在筛选后期,大批细胞死亡,不换液没有死亡的细胞就会受到死亡细胞的影响,换液后残留的少量细胞对培养基的同化作用不强,也不利于生长。我是用适应性培养基来解决这一问题的:

适应性培养基的配制

a 培养同源细胞至半汇合状态时,更换一次培养液,再继续培养2448小时后,吸出所有培养液

b 离心:30004000rpm 10 min后,吸取上清液

c 虑过:再经直径0.22um滤器过滤,再加入2倍体积的新鲜培养基,低温冻存备用。

 

eeflying

1. G418筛选要做预试验确定最佳浓度,将细胞稀释至1000cell/mL,每孔100uL加入有培养基的24孔板,将每孔中的G418浓度稀释至010020030040050060070080090010001100ng/mL12个级别。培养10-14天,以最低细胞全部死亡浓度为基准,一般400-800左右,筛选时比该浓度再高一个级别,维持使用筛选浓度的一半。

. 我们掌握是传过10代以后用维持量,但不能不用,因为有时候抗性基因会丢失,如果没有G418,很快会形成优势的。

. 即是有G418抗性,也不一定有目的基因,单克隆化操作是很重要的。

转染后,每个细胞内目的基因与宿主染色体的整合状况是不同的,目的蛋白表达有的多,有的少,外源蛋白表达少的细胞由于代谢负荷较小,所以生长较快,在生长若干代之后,表达少的细胞会形成优势,长期之后,表达最弱的细胞会由于竞争优势占主要,转绿色荧光蛋白基因后,表达越来越暗就是这个道理。所以,要进行单克隆化操作,使得到的均来自于同一祖先细胞,遗传性状尽量一致,也是对高表达细胞的保护。

操作用96孔板法,每代细胞长满后,大多数冻存,留200cell左右就可以进行该操作了, 该方法在很多关于单克隆抗体和细胞原代培养书中均有讲述。

1. 可以肯定的是,外源基因与宿主染色体之间的整合是随机的而且不是单拷贝的,这点我们做过FISH验证过,表达量与整合数目,上游序列特性,特定部位DNA立体结构都是相关的,装入了SV40只是增加了表达了数目,但并不能掩盖其它因素对表达的影响。按你的讲法,转染完GFP的细胞应该亮度一致,但实际上差别很大。neo基因也是这样,而且,同一细胞中不同基因的拷贝数不会相同,不同细胞同一基因的数目也不会相同,这点可以用数学关于泊松分布的观点理解。有时,neo表达了,但目的基因丢失了的情况也是有的。

2. 那为什么还要筛选基因?是这样,用概率论的思维来理解,某一细胞内随机含有一定数目拷贝数外源基因基因,那么,一种基因拷贝数为0的可能性,及所有拷贝均为另一种基因的概率就很小,很大的概率为外源基因的不均质。打个比方,一个大口袋,抓100个红球,再抓100个黄球,然后以从中抓若干个,这些球均为红球的概率有多大呢?应该是很小的。红球就是neo,黄球就是你的目的基因。我们用neo,实际上是筛选的外源基因整合的数目,怎么说呢?用刚才的例子来说,如果我们抓着5个红球,另一次抓着10个红球,可以肯定,第二次抓的球比较多,那么第二次黄球数目比第一次多的概率就很大了。因为二者出现的概率比是恒定的。

3. 维持就是只要养这种细胞,就要维持。可以再低些,但不能没有。或者隔一定时间从新使用筛选量压一下,我不知你是否干临床,想想抗生素的用药原则,反向思维一下,实际上我们在筛选耐药株呀。

4. neo的产物是酶,过高的G418浓度就要有更多的neo酶来支持,否则细胞也要被毒死的,而此时过多的酶要求会对细胞代谢造成太大负担,细胞可能因此无法完成分裂与增殖,我们曾试过,即使在同一转染阳性细胞,在不同浓度的G418液中生长速度也不同,严重形态也不同。这就是酶与底物的比例关系嘛,这回不用数论的,用米氏方程理解吧。

5. 胰酶的作用不必理会,有的细胞受影响,还有的细胞不受影响,由几代之后,不受影响的细胞会占优势的。

仅是我从临床抗生素和化疗药的使用原则中悟出的道理,实在是个人经验,而且在基础科学领域顶多算票友,我还是想听听诸位专业人士的理解和经验。

在第10天左右就手挑单克隆或者96孔板单克隆操作了

本帖开始我就讲了如何确定基准浓度,筛选浓度是基准浓度的高一级,维持用筛选浓度的一半。

 

Feynman_R

汇合度(confluence)也许是我们实验室的翻译,实际上就是指细胞占培养表面的比例,如果细胞铺满了整个容器,我们就认为它们100%汇合,也就是汇合度100%

最近的一个实验是:3×106细胞电转后,我把电激杯中的细胞分别接种1/40001/10001/30024孔板中,48小时后加g418筛选,这个时候接种了1/300细胞的孔会大约50%汇合,而理论上接种了1/4000细胞的孔会4%左右汇合,今天是筛选后第9天,观察到1/4000孔有两三个小克隆,按道理1/300孔会有20-30个克隆,但实际的情况是它们几乎全部死光了,仅有少数存活细胞!

所以我认为汇合度对g418筛选影响很大,这耽误了我将一个多月。

jiangql 同意菊花与刀对你的建议。我的感觉G418筛选时间太长,到后来一般会对细胞生长有影响。以下是一些建议,供参考:

首先需要扩增细胞,冻存部分中间产物细胞后,再做克隆化比较合适,否则一旦污染就会全军覆没。

一般57天后G418就可以减半维持。

勤换液,去除死细胞,可以减少对存活细胞的影响。

血清浓度可以高到20%,质量要好。

进行真核转染的一般程序:

克隆目的基因(经测序验证)—准备真核表达载体-将目的基因插入表达载体中-转染-筛选-鉴定

下面以pcDNA3载体p16为目的基因,介绍真核转染的实验操作。

一、             试剂准备

1 HBSHepes-buffered saline):876mg NaCl溶于90ml ddH2O,加入1M Hepes,pH7.4,ddH2O100ml, pH7.4,滤过除菌。

2、核酸贮存液,过滤除菌。

3、培养基:含血清或不含血清的,用于转染细胞的正常培养。

二、操作步骤

(一)克隆目的基因

1、根据GenBank检索的目的基因序列,设计扩增引物,并在上、下游引物的5’-端分别引入酶切位点BamHXho,行RT-PCR

2、回收特异性扩增片段,连入T载体。

3、转化DH5α,质粒制备。

4、酶切初步鉴定,测序证实。

(二)      真核重组表达载体的构建:

pcDNA3载体带有在大肠杆菌中复制的原核序列、便于挑选带重组质粒细菌的抗生素抗性基因,以及表达外源DNA序列所必需的所有真核表达组件。

重组质粒与pcDNA3分别用BamHXho双酶切

回收插入片段和pcDNA3线性片段

T4连接酶连接

转化DH5α

质粒制备

BamHXho双酶切鉴定。

(三)重组pcDNA3转染SHG-44细胞:

    1 G418筛选浓度测定:SHG-44培养于24孔培养板→G418 分别用100mg/L200mg/L300mg/L400mg/L500mg/L600mg/L加入,各浓度3复孔,设正常对照3复孔。以10-14天细胞全部死亡的浓度为筛选浓度,结果为200mg/L

2 在转染实验前天接种细胞,各种细胞的平板密度依据各种细胞的生长率和细胞形状而定。进行转染当天细胞应达到60%-80%覆盖。一般要求,6孔培养皿(35mm),每孔1-2ml培养基3×105细胞。依据不同大小培养板调整每平方厘米的细胞数量。

                     典型贴壁细胞平板密度

培养板大小
生长面积(cm2
大约细胞数
培养基容积(ml
组织培养皿(φ60mm
28
66×105
5-6
6孔培养板(φ35mm
9.5
3×105
1-2
12孔培养板φ22.6mm
4
13×105
05-1
24孔培养板(φ8mm
05
06×105
025-05

3 SHG-44细胞的转染:

(1)   转染当天,加入脂质体/ DNA混合物之前的短时间内,更换1ml新鲜的有血清或无血清培养基。

(2)   准备不同比例的DOSPER/ DNA混合物,以确定每个细胞系的最佳比例。 溶液A:用HBS稀释DNApcDNA3、重组pcDNA3)各1.5μg 到总体积50μl30μg/ml)。溶液B:用HBS稀释6μl脂质体到终容积50μl120μg/ml)。混合溶液AB,轻柔混合(不要振荡),室温孵育15min,以便脂质体/DNA混合物形成。

(3)   不要移去培养基,逐滴加入100μl 脂质体/DNA混合物(从培养孔一边到另一边),边加边轻摇培养板。

(4)   37孵育6hr

(5)   6hr后更换转染培养基,加入2-3ml新鲜生长培养基。

(6)   转染24hr后施加筛选压力,改用含G418的培养基培养。

4 G418筛选:在G418筛选浓度下持续培养14天后,挑出单克隆,扩大培养,同时转染pcDNA3SHG-44-vect,并设对照组细胞即SHG-44

(一)筛选结果鉴定:

1)基因组DNA提取→PCR鉴定外源基因

2SHG-44-重组pcDNA3阳性细胞、SHG-44-vect裂解聚丙烯酰胺凝胶电泳免疫印迹鉴定P16蛋白表达(Western-blot)。

3)测定外源性基因对SHG-44细胞增殖的影响

流式细胞仪分析:SHG-44SHG-44-vectSHG-44-重组pcDNA3→单细胞悬液→70%酒精固定裂解细胞核糖核酸酶消化碘化丙啶染色上机分析G1期和G2/MS期比例。

细胞生长曲线测定:SHG-44SHG-44-vectSHG-44-重组pcDNA3→5×104/孔接种24孔培养板→24hr后各自用苔盼蓝染色计数细胞计算细胞生长抑制百分率。

软琼脂克隆形成率分析:SHG-44SHG-44-vectSHG-44-重组pcDNA3→104 细胞→0.3%低熔点琼脂糖培养→1-2周后计数不可少于50个细胞的克隆数计算克隆形成率抑制率。

三、注意事项

1、    优化转染条件(脂质体的用量、DNA密度、细胞密度、脂质体和DNA混合孵育时间)每种细胞和质粒均须进行。用于转染的核酸应高度纯化。为避免微生物污染,所用溶液滤过灭菌,以及随后的使用应在无菌条件下,这是细胞惯常的做法。但是,脂质体以及脂质体/ DNA混合物无需滤过除菌。

2、    预备脂质体/DNA混合物必须在无血清下进行。但是在随后的脂质体/ DNA与被转染细胞共孵育的过程中,血清又是培养基的一部分。

3、    在转染之前更换培养基,可提高转染效率,但所用培养基必须37预温。

4、    脂质体/ DNA混合物应当逐滴加入,尽可能保持一致,从培养皿一边到另一边,边加入边轻摇培养皿,以确保均匀分布和避免局部高浓度。

 

常见问题和解答:

Q:我觉得套环法操作不如96孔办法效率高。

A也不一定.依据实验目的与要求而定. 如果克隆效率较低的细胞,套环可能更好.96孔板法,如果不是每孔单个细胞,就不能保证是单克隆.即使是增加到每孔十几个细胞或上百个,一个96孔板也只能培养一万个细胞,十万个细胞就至少需要10个板,100万个细胞就需要100个板,对于转基因细胞筛选或基因打靶,工作量就太大了.且细胞在单独生长条件下,远远不如千万个细胞共同培养活力好. 因此还得看这位朋友使用的是什么细胞,有限细胞系还是无限细胞系,转基因还是非转基因,筛选还是不筛选,需要的单细胞克隆株数量多少?

 

Q请问一种细胞如果转染了稳定表达的,含neo抗性基因的质粒后,如何用G418筛选?我查看了国内、外50几篇文献后发现没有一个定论的说法。即使对于同一种细胞其筛选剂量和筛选时间也不一样。我自己认为,从理论上讲,如果稳定表达最好要一直筛选到细胞传代后。不知这种观点对不对。然而开始筛选的剂量、维持剂量以及筛选持续时间又该如何确定?维持剂量与开始筛选时的剂量是否有一定关系?

A1. G418筛选要做预试验确定最佳浓度,将细胞稀释至1000cell/ml,每孔100ul加入有培养基的24孔板,将每孔中的G418浓度稀释至0,100, 200,300, 400,500, 600,700, 800,900, 1000,1100ng/ml等12个级别, 培养10-14天,以最低细胞全部死亡浓度为基准,一般400-800左右,筛选时比该浓度再高一个级别,维持使用筛选浓度的一半。

2。我们掌握是传过10代以后用维持量,但不能不用,因为有时候抗性基因会丢失,如果没有G418,很快会形成优势的。

3。即是有G418抗性,也不一定有目的基因,单克隆化操作是很重要的。

 

Q:请问:能谈一谈单克隆化操作的步骤以及其与目的基因表达的关系吗?

A:转染后,每个细胞内目的基因与宿主染色体的整合状况是不同的,目的蛋白表达有的多,有的少,外源蛋白表达少的细胞由于代谢负荷较小,所以生长较快,在生长若干代之后,表达少的细胞会形成优势,长期之后,表达最弱的细胞会由于竞争优势占主要,转绿色荧光蛋白基因后,表达越来越暗就是这个道理。所以,要进行单克隆化操作,使得到的均来自于同一祖先细胞,遗传性状尽量一致,也是对高表达细胞的保护。操作用96孔板法,每代细胞长满后,大多数冻存,留200cell左右就可以进行该操作了,该方法在很多关于单克隆抗体和细胞原代培养书中均有讲述,我就不赘述了。

必须指出,单克隆化要做几遍,一遍是不够的,我前十代都是这样的,结果绿色荧光蛋白不但没减弱,反而增强了很多。现在很多代了,很稳定。

 

       Q1。我的质粒中含有SV40neo基因,好像就不存在外源蛋白表达少的细胞形成优势这个问题了吧。

2。按您的讲法,筛选要进行10代,那么维持剂量要进行多长时间?如果我使用对照组,在对照组细胞全部死亡后就用维持剂量进行培养行吗?

3。在细胞用胰酶进行传代时,此时细胞膜受到一定影响,如果培养基中存在G418对细胞是否有影响?

4。既然细胞表达neo,从理论上讲是否无论多大浓度的G418对之都无影响?

A1.可以肯定的是,外源基因与宿主染色体之间的整合是随机的而且不是单拷贝的,这点我们做过FISH验证过,表达量与整合数目,上游序列特性,特定部位DNA立体结构都是相关的,装入了SV40只是增加了表达了数目,但并不能掩盖其它因素对表达的影响。按你的讲法,转染完GFP的细胞应该亮度一致,但实际上差别很大。neo基因也是这样,而且,同一细胞中不同基因的拷贝数不会相同,不同细胞同一基因的数目也不会相同,这点可以用数学关于泊松分布的观点理解。有时,neo表达了,但目的基因丢失了的情况也是有的。

2。那为什么还要筛选基因?是这样,用概率论的思维来理解,某一细胞内随机含有一定数目拷贝数外源基因基因,那么,一种基因拷贝数为0的可能性,及所有拷贝均为另一种基因的概率就很小,很大的概率为外源基因的不均质。打个比方,一个大口袋,抓100个红球,再抓100个黄球,然后以从中抓若干个,这些球均为红球的概率有多大呢?应该是很小的。红球就是neo,黄球就是你的目的基因。我们用neo,实际上是筛选的外源基因整合的数目,怎么说呢?用刚才的例子来说,如果我们抓着5个红球,另一次抓着10个红球,可以肯定,的二次抓的球比较多,那么第二次黄球数目比第一次多的概率就很大了。因为二者出现的概率比是恒定的。

3。维持就是只要养这种细胞,就要维持。可以再低些,但不能没有。或者隔一定时间从新使用筛选量压一下,我不知你是否干临床,想想抗生素的用药原则,反向思维一下,实际上我们在筛选耐药株呀。

4。neo的产物是酶,过高的G418浓度就要有更多的neo酶来支持,否则细胞也要被毒死的,而此时过多的酶要求会对细胞代谢造成太大负担,细胞可能因此无法完成分裂与增殖,我们曾试过,即使在同一转染阳性细胞,在不同浓度的G418液中生长速度也不同,严重形态也不同。这就是酶与底物的比例关系嘛,这回不用数论的,用米氏方程理解吧。

5。胰酶的作用不必理会,有的细胞受影响,还有的细胞不受影响,由几代之后,不受影响的细胞会占优势的。

   仅是我从临床抗生素和化疗药的使用原则中悟出的道理,实在是个人经验,而且在基础科学领域顶多算票友,我还是想听听诸位专业人士的理解和经验。

Another answer:

1.外源基因整合后的基因表达量与整合的位置高度相关,如果整合发生在活性转录染色质区,则有利于表达。通常用的载体是靠非同源重组随机整合的,所以为了获得高表达细胞株,需要对重组克隆进行筛选。某些载体如pcDNA3包含SV40的复制起始位点,可以是质粒在反式提供大T抗原的细胞系中复制,增强瞬时表达,有利于提高质粒的随机整合几率。对普通的表达载体来说,即使抗性基因表达也无法保证外源基因的整合,表达载体随机整合的结果常常导致目的基因的损坏甚至丢失。

2。关于概率论的思维,我认为红球和黄球的比喻很形象,但未必准确。因为抗性基因和目的基因有一定的联锁,并不是完全相互独立的。

QG418怎么配制?

A:我觉得不能用水配,因为这样PH会变化很大,至少要用PBS。我是配在HEPES溶液中的,具体方法如下:1g包装的G418瓶子中,加入10ml HEPES溶液,浓度为100 mg/ml完全溶解后,0.22 um过滤,-20度保存。HEPES缓冲液配方如下:90 ml 水中,0.8 g NaCl, 0.037 g KCl, 0.0135 g Na2HPO4.2H2O, 0.1 g 葡萄糖,0.5 g HEPES,溶解,NaOHPH7.05,定容至100ml

Good answer:

推荐用HEPES。特别是当细胞对G418不敏感,G418使用浓度高时,如果用水、PBS配置,会极大的改变细胞培养基的pH值,影响细胞的生长。1mol/L HEPES的简单配置:HEPES 11.91g,溶解于40mlddH2O,用10mol/LNaOH调节pH7.5-8.0,定容至50ml0.22um小滤器过滤。HEPES最终使用浓度15-20mM

 

Q: 我想一步筛选出高拷贝整合的高表达的细胞克隆,如果我用很高浓度的G418直接加进培养瓶直接筛选,这样做可以吗?我做过G418杀伤曲线,300ug\ml就基本上可以杀死细胞,我想直接用1000ug\ml来筛选,不知是否可行?会不会有什么问题?

A: G418筛选要做预试验确定最佳浓度,将细胞稀释至1000cell/ml,每孔100ul加入有培养基的24孔板,将每孔中的G418浓度稀释至0,,100, 200,300, 400,500, 600,700, 800,900, 1000,11 .00ng/ml等12个级别, 培养10-14天,以最低细胞全部死亡浓度为基准,一般400-800左右,筛选时比该浓度再高一个级别,维持使用筛选浓度的一半。

G418浓度太高也不好,会对细胞的损伤太大,影响增殖。我用过Zeocin,为了加速筛选,用了最低剂量的两倍浓度,结果一个阳性克隆都没筛到,欲速则不达。

 

Q: 我用24孔板做了G418筛选的浓度梯度,确定最低致死浓度为600mg/l。我现在用这个浓度筛选我转染后的细胞,我应该保持这个浓度多少天才能确保我筛选完成呢?在这期间可以换液吗?筛选完了之后存活的细胞再培养传代的话,培养基中是否还应该加一定浓度的G418?如果要加的话什么浓度比较合适?

A: 应该保持这个浓度9天以上,每3天换液一次。筛选完了之后存活的细胞再培养传代的话,培养基中应该加一定浓度的G418,一般在最低致死浓度的60%左右。

 

Q: 6孔板里进行NIH3T3细胞转染后的G418筛选,2周后单克隆形成,于是就挑取单克隆,之前6孔板里的细胞很多,用0.125%typsin+0.25%EDTA消化,1000/分离心10分钟 ,肉眼可以 看到细胞沉淀,接种至25ml塑料培养瓶中,镜下看密度可以,但是细胞形态成多态性:少量是圆形,大多数是梭形。第2天一看没有细胞贴壁!做了2次都这样,请问我的操作步骤有问题吗?

A: 看了你的操作步骤,个人观点认为你挑出来的不能称之为单克隆,在6 孔板里用G418筛选两周后只是大部分细胞死亡,少数细胞存活并逐渐生长,只能叫作克隆形成。

我们一般在转染后24h将细胞消化下来(0.25%trypsin + 0.02%EDTA),以110或更高的比例传代,贴壁24h后加选择性培养基开始筛选。待大部分细胞死亡,极少数细胞渐形成克隆。再把这些克隆经24孔板、6孔板放大后再进行单克隆化的操作(具体操作方法见附件)。从严格意义上来讲,单克隆化的操作一般要进行2-3次,经此操作后长起来的才能称之为单克隆。另外,在把克隆或单克隆放大的过程中动作一定要轻柔,否则很容易出现你所说的细胞不贴壁死亡的现象,也可以在消化完用正常培养基,待细胞贴壁后再换为含G418的培养基。还有,在多克隆形成后一定要及时冻存,以备后续试验。

你挑选的克隆,不能贴壁原因可能有二;一、细胞很少,那么你接种后,由于密度较低,细胞是接触生长,所以密度太低,细胞难以生存。二、拟消化下来可能用G418筛选液筛选,这样也会死亡。消化后先用无G418的培养液培养,贴壁后,再换取G428 培养液。

 

Q:我想问怎样的方法可以把阳性克隆从培养瓶中取下来,书上说用弯头吸管,我试了,不好用,根本就不能完整的吸取总个阳性克隆细胞下来,我想着用刮勺,但进口的特别贵,所需又不多,你看有什么别的好办法吗?谢谢了!

A: 如何挑选克隆。你可以按以下操作方法进行:

【操作方法】

1)将已形成克隆的培养皿置于显微镜下观察克隆位置,并将各个克隆位置用标记笔标记准确;

2)在超净台内,弃去培养皿内的培养液;

3)用镊子夹取一块滤纸块,用0.25%Trypsin消化液浸湿,置于所标记克隆位置处,5-20秒;(有人可提前在一孔中装入0.02%EDTA PBS

4)将24孔培养板每孔加G418 选择培养基2ml,用镊子取出已黏附克隆细胞的滤纸快,置于一个孔中的培养基中,涮洗滤纸块数次,以使黏附的细胞脱落下。镜下观察确认细胞已经脱落后,将滤纸块取出弃掉,其它克隆方法转移同上;(有人在细胞贴壁后再选用培养基)

5)将移有克隆细胞的24孔培养板,继续置375%CO2培养箱培养,2-5天;

6)待细胞长满后,0.25%Trypsin消化液消化,并将细胞转移至6孔板继续培养,或转入多瓶中扩增,此后可做进一步鉴定工作。

 

Q: G418HEp-2细胞的建系已经有2个月了,已经在细胞瓶中扩大培养,但发现与正常HEp-2细胞相比,建系的细胞生长得很慢,细胞间的边界也不是很清楚,而且细胞长得不均匀,这样正常吗?为改变这一状态,我该怎么做呢?谢谢!

A: 基本算正常吧。稳定转染的细胞据细胞种类不同其形态都较正常细胞有变化,有的很明显,比如说细胞变大,生长缓慢,细胞界限不明显及细胞爱成堆生长等等;有的则变化不明显。对于稳定转染的细胞,建议筛出单克隆后大量冻存。一方面防止细胞回复,因为你转入的质粒对于细胞而言毕竟是个负担,细胞较倾向于甩掉负担轻装前进,这一点对于肿瘤细胞尤甚;另一方面,如果插入的质粒明显和细胞周期有关的话,这种稳定转染的细胞传不了几代就会死亡。在传代过程中,也可以使用正常培养基,但过一段时间一定要用维持剂量的含G418的培养基压一压,以除去回复的细胞。

 

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《自然》亮点:新型细胞因子IL-18,肿瘤免疫治疗迎来新进展

《自然》亮点:新型细胞因子IL-18,肿瘤免疫治疗迎来新进展

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今日,顶尖学术期刊《自然》发表了一篇有关IL-18在肿瘤免疫疗法领域研究进展的论文。这篇备受关注的论文来自耶鲁大学免疫系的Aaron Ring教授团队 (第一作者为周挺博士)。

IL-18(interleukin-18)在1993年被Nakamura等人发现【1】,并随后在1995年被Okamura等人克隆出来【2】。因其具有强烈的诱导细胞产生γ干扰素(IFN-γ)功能,开始被称为干扰素诱导因子(IFN-γ Inducing Factor, IGIF),后被重新命名为IL-18,归属于IL-1家族。

早期的研究发现,IL-18和其同家族成员IL-1β比较类似,都属于先天预警分子(alarmin)。IL-18在细胞内以非活性前体方式(pro-IL-18)大量存在于上皮细胞、巨噬细胞和树突细胞中,在炎症发生时被重组的NLRP3炎症小体组分caspase-1切割成为活性IL-18迅速释放【3】。IL-18通过结合其异源二聚体受体 (IL-18Rα/Rβ) 介导MyD88-NFκΒ信号通路。由于其受体在自然杀伤细胞(NK)上的高表达,IL-18因此能够刺激NK细胞分泌产生IFN-γ,并具有广阔的免疫调节功能。

由于IL-18能够诱导免疫细胞的增殖并活性增强的特性,近年来其在抗肿瘤上的作用被广泛研究。譬如IL-18被报道通过增强NK细胞的ADCC效应从而杀伤肿瘤【4】,与免疫检查点抑制剂有协同效应【5】以及被装进CAR-T载体中作为效应分子【6】。在一项2016年结束的研究重组IL-18治疗霍奇金淋巴瘤的临床试验中,IL-18显示出了良好的安全性,但是对于肿瘤没有有效性【7】。IL-18的强免疫激活特性和临床试验结果的巨大反差,引起了Aaron Ring团队的兴趣。

他们首先通过生物信息学和免疫学实验证实,IL-18及其受体在肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)中的表达上调(图1a和1b),暗示了IL-18跟机体抗肿瘤的免疫力的相关性。随后他们分析临床试验失败的研究报告发现,具有超高亲和力的IL-18假受体(decoy receptor)IL-18BP,在病人体内被大量诱导表达【8,9】。这一现象也被Aaron Ring团队通过多种手段包括人体肿瘤免疫组化(图1c)、血清蛋白测定以及小鼠模型中证实,并通过IL-18BP敲除的小鼠模型确定了其能够抑制IL-18的抗肿瘤效果。

▲图1:IL-18受体和IL-18BP在肿瘤中诱导表达(图片来源:参考资料[13])

Ring博士使用蛋白质定向进化和酵母展示等手段改造蛋白质的功能,曾经成功开发过IL-2突变体“super-2”【10】、SIRPα突变体【11】和PD1突变体【12】等案例。基于以上发现,Aaron Ring团队通过定向进化手段改造了IL-18突变体DR-18(decoy-resistant IL-18),使其能够保持IL-18原有的信号激活功能而不被IL-18BP抑制(图2)。

▲图2:定向进化改造DR-18(图片来源:参考资料[13])

与野生型IL-18相比,改造后的DR-18在多种小鼠肿瘤模型中均显示出良好的抗肿瘤活性,其单独疗效甚至优于抗PD-1单药治疗,且与抗PD-1联合用药展现出良好的协同效应(图3)。

▲图3:DR-18单药和PD-1抑制剂联用均显示良好的抗肿瘤效果(MC38模型)(图片来源:参考资料[13])

通过单细胞测序,研究人员发现DR-18处理的老鼠肿瘤微环境和PBS以及野生型IL-18的截然不同,它极大的激活了肿瘤内多种免疫细胞,包括T淋巴细胞、巨噬细胞以及中性粒细胞等(图4a)。尤其是对于肿瘤杀伤最重要的CD8 T细胞,DR-18将绝大部分肿瘤浸润CD8 T细胞重塑成高表达效应分子和共刺激分子的强效应细胞群 (cluster CD8_1, TEFF),而其他两项对照组却以耗竭CD8 T细胞群为主 (cluster CD8_2, TEX) (图4b)。

▲图4:DR-18重塑肿瘤微环境(图片来源:参考资料[13])

进一步深入的免疫学实验发现的DR-18抗肿瘤的作用机制可总结为:1)DR-18增加了各类淋巴细胞浸润肿瘤;2)DR-18极大的增强了CD8 TIL的效应功能,使其成为多功能效应细胞且能同时分泌多种效应因子(图5a);3)DR-18增加肿瘤内高表达TCF1的CD8干细胞样前体(机体持续免疫治疗应答所需的一类细胞)的数目(图5b),并其诱导向多功能性效应CD8 T细胞分化,减少向表达TOX的衰竭型CD8 T细胞分化(图5c);4)DR-18抗肿瘤效果依赖于CD8 T细胞,且DR-18直接作用于表达IL-18受体的CD8 TIL来杀伤肿瘤;5)此外,DR-18还通过促进NK细胞的活性和成熟性,以有效治疗MHC-Ⅰ表达缺失从而对抗PD-1治疗耐药的肿瘤。

▲图5:DR-18促进CD8 TILs效应功能和记忆前体的分化(图片来源:参考资料[13])

在IL-18课题进行基础研究的同时,其转化研究也在紧锣密鼓的进行。由于鼠源和人源的IL-18对其受体交叉活性极低,Aaron Ring团队还重新改造成功了人源DR-18。改造后的人源DR-18显示出了良好的拮抗hIL-18BP的抑制功能(图6a),并能同时对于人源(图6b)和猴源细胞(图6c)具有信号激活能力,为临床前开发打下基础。DR-18的全球专利在2019年获批,并授权于以Aaron Ring为创始人的Simcha Therapeutics生物科技公司,药明康德公司致力于成为全球医药健康产业最高、最宽和最深的能力和技术平台,也积极投资了Simcha Therapeutics。截止目前为止,大部分临床前开发工作以及药物生产流程接近完成,研究型新药申请将在2020年底递交,1期临床试验将在2021年开展。

▲图6:人源DR-18功能验证(图片来源:参考资料[13])

细胞因子治疗有着辉煌的过去,它是最早的被FDA批准用于肿瘤的免疫治疗药物,譬如,IFNα-2a (Roferon-A)和IFNα-2b (Intron-A)在1986年被批准用于多种淋巴瘤,高剂量IL-2 (Proleukin)在1992和1998年被批准用于转移性黑色素瘤和肾癌。遗憾的是,彼时至今,仍未有新的细胞因子治疗获批。目前细胞因子研究集中在两方面,一方面大量临床试验研究已批准的细胞因子与传统化疗手段的联用,另一方面是开发新型的靶点和制剂。譬如Nektar公司的聚乙二醇交联IL-2 (NKTR-214)、礼来公司(收购ARMO)的聚乙二醇交联IL-10 (Pegilodecakin),以及Altor的IL-15/IL-15Rα/IgG1 Fc融合蛋白(ALT-803),这些研究赋予了细胞因子治疗新的希望,但是其起伏不定的临床试验结果还需要更长时间的观望。因此,本篇论文对于IL-18这个靶点,以及整个细胞因子免疫治疗领域,都具有重大的意义。论文中的实验结果不仅重新肯定了IL-18治疗的潜力,而且发现了IL-18BP是这一靶点的主要障碍,还提供了克服这一障碍的潜在有效手段。让我们恭喜Aaron Ring团队,也希望这一研究成果能够尽早转化为临床癌症疗法,造福广大病患。

Aaron Ring团队介绍

Aaron Ring博士2008年本科毕业于耶鲁大学分子生物物理和生物化学系,导师为Richard Lifton;2016年博士毕业于斯坦福大学结构生物学系 (MD&PhD),导师为Chris Garcia和Irving Weissman。博士期间,他研发了著名的CD122-biased IL-2突变体“super-2”(Nature, 2012),已授权给Medicenna Therapeutics进行开发。他还研发了高亲和力SIRPα拮抗突变体(Science, 2013),已授权给ALX Oncology 进行开发,产品代号为ALX-148。由于他在基础和转化研究上的诸多成就,他在2016年被福布斯杂志评为医药健康领域年度“30岁以下30人”。同在2016年,他获得NIH Director’s Early Independence Award (DP5)以及Pew-Stewart Scholar,跳过博士后训练阶段,博士毕业直接加入全美排名第一的耶鲁大学免疫系任助理教授。截止目前为止,Ring博士拥有22项全球专利,同时是Forty Seven, Inc、ALX Oncology和Ab Initio Therapeutics三家生物公司的co-founder。他在2018年独立设立Simcha Therapeutics公司,同时兼任董事会主席。

周挺博士为Aaron Ring实验室第一位博士后,是组内IL-18课题最主要负责人。他于2006年本科毕业于中国农业大学;2014年博士毕业于中科院生物物理所,博士期间工作阐明了DNA去甲基化中间产物5hmC识别的分子机制(Molecular cell, 2014);2014年9月至2016年11月在耶鲁大学分子细胞发育生物学系进行博士后训练,研究丙肝病毒特殊菌株的强致病机理(JVI, 2017);2016年11月加入Aaron Ring实验室,负责IL-18课题从体外的定向改造到体内免疫学机理鉴定(除单细胞测序外)的所有工作。同时,他还辅助Ring博士全面参与了IL-18的临床转化。因其在IL-18研究中的贡献,周挺博士曾获得耶鲁大学癌症中心2018年度圆桌会议优秀研究奖以及2019年Immuno-Oncology Young Investigator Forum (IOYIF) 优秀博士后研究奖。周挺博士还是IL-18全球专利的主要发明人之一。

参考资料:

[1] Nakamura K, Okamura H, Nagata K, Komatsu T, Tamura T. Purification of a factor which provides a costimulatory signal for gamma interferon production. Infect Immun. 1993;61(1):64-70.

[2] Okamura, H. et al. Cloning of a new cytokine that induces IFN-gamma production by T cells. Nature 378, 88-91, doi:10.1038/378088a0 (1995).

[3] Mantovani A, Dinarello CA, Molgora M, Garlanda C. Interleukin-1 and Related Cytokines in the Regulation of Inflammation and Immunity. Immunity. 2019; doi:10.1016/j.immuni.2019.03.012.

[4] Srivastava S, Pelloso D, Feng H, et al. Effects of interleukin-18 on natural killer cells: costimulation of activation through Fc receptors for immunoglobulin. Cancer Immunol Immunother. 2013;62(6):1073-1082. doi:10.1007/s00262-013-1403-0.

[5] Ma, Z. et al. Augmentation of Immune Checkpoint Cancer Immunotherapy with IL18. Clin Cancer Res 22, 2969-2980, doi:10.1158/1078-0432.CCR-15-1655 (2016).

[6] Hu, B. et al. Augmentation of Antitumor Immunity by Human and Mouse CAR T Cells Secreting IL-18. Cell Rep 20, 3025-3033, doi:10.1016/j.celrep.2017.09.002 (2017).

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No.8 Dr.Luo的正畸病例,#杭州矫牙#多颗#埋伏阻生牙#

杭州牙齿矫正专家骆英

06/22/2020

No.8 Dr.Luo的正畸病例,#杭州矫牙#多颗#埋伏阻生牙#,18岁健康男孩,竟然有12颗恒牙未萌出,拍片子一看,宝宝们都在深处冬眠呢,在“当时红遍杭州半城的“巫大仙”分次开窗手术后,在深井粘上附件,一颗一颗耐心地“钓鱼”…….历时3年,非常顺利地完成了。相信很多正畸医生干一辈子也没碰到这么多埋得这么深(紧贴下颌体下缘),窃笑:艺高人胆大。 

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干槽症发生的原因及防治——薛洋博士

干槽症发生的原因及防治——薛洋博士

原创 今日口腔 中国医学论坛报今日口腔 2019-08-06

作者:薛洋 胡开进 刘平 李登科

空军军医大学第三附属医院

什么是干槽症?

干槽症(dry socket 或alveolalgia),是一种备受关注的拔牙后并发症,最早由Crawford 报道于1896 年。此后,因对疾病特征、病因、病理的看法不同提出了多种命名,如牙槽骨骨炎(Alveolar osteitis)、纤维溶解性牙槽炎(fibrinolytic alveolitis)、纤维溶解性骨炎(fibrinolytic osteitis)、局限性骨髓炎(localized osteomyelitis)、疼性干性牙槽炎(alveolitis sicca dolorosa)、术后牙槽炎(postoperative alveolitis)、腐败性牙槽症(septic socket)、坏死性牙槽症(necrotic socket)等。目前国内较为常用的名称为干槽症,国际常用的为dry socket。

干槽症在组织病理学上主要表现为牙槽骨壁的骨炎或轻微的局限性骨髓炎,而最主要的临床症状则为“疼痛”,即拔牙2~3天后出现剧烈疼痛,并向耳颞部、下颌区或头顶部放射,一般镇痛药物不能止痛。因此,疼痛常常是患者的唯一主诉,也是与其他疾病鉴别的关键所在。干槽症应与拔牙后创伤及反应性疼痛、拔牙后感染性疼痛、其他牙(特别是邻牙)牙髓炎、三叉神经痛、关节区疼痛、颞间隙感染等相鉴别。其鉴别要点:疼痛性质、疼痛部位、疼痛开始时间、邻牙情况和局部组织有无红肿五方面,详见表1。

表1 干槽症的诊断与鉴别诊断

除特征性疼痛外,拔牙窝内的特征性改变是干槽症诊断和鉴别诊断的另一要点。根据拔牙窝内的改变,干槽症可以分为腐败型干槽症和非腐败型干槽症。腐败型干槽症是指拔牙窝内空虚或有腐败变性的血凝块,腐臭味强烈;而有部分病员虽有剧烈疼痛和拔牙窝空虚,但没有明显腐败物存在,按干槽症处理后可以止痛,因此有人将这类情况归为非腐败型干槽症(图1,表2)。以往腐败型干槽症的发生率明显高于非腐败型干槽症,但近年来随着围手术期预防性使用抗生素方面的完善,非腐败型干槽症的发生比率明显增高。

图1 腐败型干槽症与非腐败型干槽症的临床表现

表2 腐败型干槽症与非腐败型干槽症的鉴别诊断

干槽症的病因

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解剖因素

干槽症的病因有多种 创伤因素学说,如感染学说、解剖因素学说、创伤学说、纤维蛋白溶解学说等,但均不能全面解释干槽症的发病及临床表现。由此也可以看出,干槽症的确切病因至今不是十分明确,但可以确定的是解剖因素和创伤因素在干槽症的发生中发挥着重要作用。

下颌牙拔除后干槽症的发生率显著高于上颌,究其原因,可能与下颌骨皮质较厚从而导致下颌牙拔除后拔牙窝血液供应不良有关。当然,也有人认为是因为下颌牙拔除难度较上颌大,因此创伤也较大,即后面要讨论的创伤因素。此外,干槽症最多见于下颌后牙,发生率依次为:下颌第三磨牙、下第一磨牙、第二磨牙,其他牙少见,前牙发生率最低。这可能与下颌第三磨牙拔除后,骨腔大,血凝块不易附着有关。

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创伤因素

Krogh 在1937 年提出创伤在干槽症病因中起重要作用。本课题组通过临床对照研究亦证实:使用基于外科专用切割手机等微创拔牙器械,并通过微创的技术拔除下颌第三磨牙,与传统的敲击方法相比可以明显降低干槽症等拔牙术后并发症的发病率(图2)。此外,还有许多研究均认为创伤为干槽症的主要发病因素之一。但创伤引起发病的机制有不同的解释,如:①使用传统敲击方法增隙或以牙槽骨为支点大力挺出患牙时,所产生的创伤均可导致牙槽窝表面硬骨板因压缩、折裂而发生缺血和局部骨髓炎。这也就是为什么我们时常可以听见有医生抱怨说:“这个垂直位的下颌智牙,我一挺子就出来了,怎么还干槽了呢?”;②创伤使骨壁的血管栓塞,导致牙槽窝内血凝块形成障碍;③创伤使骨组织易发生继发感染;④创伤产生的组织胺影响伤口愈合;⑤创伤骨组织使组织活化剂释放,导致纤维蛋白溶解等。

图2 两种方法对下颌阻生第三磨牙拔除术后并发症的影响,右表引自下颌阻生第三磨牙两种拔除方法的比较(实用口腔医学杂志,2010)

除上述因素以外,还有许多病因被提出,如全身因素、吸烟、性别、年龄(21~40 岁明显高于其他年龄段)、月经周期、口服避孕药、口腔卫生状况、局麻药中加入血管收缩剂、牙槽窝过度冲洗等,但尚未得到业界的公认。目前认为干槽症的病因是综合性的,起作用的不是单一因素,而是多因素的综合作用结果。

干槽症的处理

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非腐败型干槽症的处理

干槽症的治疗,一定要对“症”下药,而非不分青红皂白地狠命刮。

针对非腐败型干槽症,建议使用生理盐水冲洗拔牙窝,冲洗干净后,放入适量药物封闭拔牙窝即可。牙槽窝内放置的药物可以选择专用的干槽糊剂、滴有丁香油的止泰或盐酸米诺环素(图3)。

图3 非腐败型干槽症的处理

但应注意:①药物使用的量不宜过多,更无需使药物充填满整个拔牙窝;②不能将不可吸收糊剂(如氧化锌丁香酚糊剂等)充填牙槽窝,以免导致局部长期异物反应,严重者可引起慢性颌骨骨髓炎或使患者出现类似三叉神经痛的症状。

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腐败型干槽症的处理

通过下牙槽神经阻滞麻醉,在完全无痛的情况下彻底清创。使用3%过氧化氢溶液棉球反复擦拭,以去除腐败坏死物质,直至牙槽窝清洁,棉球干净无臭味;除非存在大块腐败坏死物,否则不要使用刮匙反复搔刮牙槽骨壁。用生理盐水冲洗牙槽窝。将碘纺纱条(可加丁香油和2%地卡因)填入拔牙创,先将纱条的一端填入牙槽窝底部,再依次叠列严密填满牙槽窝,松紧适度,最后将纱条末端塞入牙槽窝深部避免松脱,也可缝合两侧牙龈。经上述处理后,绝大多数可完全或基本止痛。如无明显疼痛,次日可不再换药。10天后去除碘条,此时牙槽窝虽空虚,但骨壁表面有一层肉芽组织覆盖,不需再放新碘条。牙槽窝待1~2个月后才能长满结缔组织。

干槽症的预防思路

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减少手术创伤

因病因和发病机制尚不明确,所以截止目前,我们仍缺乏有效的干槽症预防措施。其预防思路主要集中在减少手术创伤、防止血凝块脱落和拔牙窝充填三个方面,但笔者认为,通过标准化的器械、微创化的技术、规范化的操作减少手术创伤是重中之重。

如前所述,许多研究均认为创伤为干槽症的主要发病因素之一。本课题组也通过临床对照研究证实利用磨切法拔除下颌阻生第三磨牙可以有效降低干槽症的发生率。分析其原因,采用微动力系统操作时,在增隙时磨除了牙槽窝表面的硬骨板,暴露出骨板下的松质骨,避免了传统增隙法导致的牙槽窝表面硬骨板因压缩、折裂而发生缺血和局部骨髓炎。

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防止血凝块脱落

拔牙窝空虚、血凝块脱落是干槽症非常重要的临床表现,因此有人提出采用缝合牙龈的方式保护血凝块,防止其脱落。但笔者并未检索到相关的研究证据支持。此外,拔牙窝的适当敞开有利于引流,从而减少术后肿胀、疼痛等。对于完全埋藏的下颌阻生第三磨牙,特别是低位埋藏的第三磨牙,偶可见拔除后1月左右患者突然出现面部肿胀等间隙感染的症状。分析其原因可能与拔牙后缝合过于严密有关。严密缝合后牙龈组织快速愈合(1~2周),而拔牙遗留的骨腔被充满则需要1~3个月。细小的食物残渣、细菌等可以顺第二磨牙远中龈袋进入拔牙窝内,但无法引流排除,从而聚集引发感染。此类患者治疗时,除全身抗感染治疗外,局部治疗是关键:通常需要将牙龈切开,冲洗牙槽窝后保持开放引流。基于上述分析,即便使用缝合的方式来预防血凝块脱落,也不建议严密缝合(图4)。

图4 缝合方式

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拔牙窝充填

在拔牙窝内填塞各类抗感染、保护血凝块、减小拔牙创体积的物质,均取得了一定的效果。2019年最新的研究表明富含血小板的纤维蛋白等具有促进骨形成功能的自体材料在预防干槽症的同时可以减少牙槽骨的吸收。但拔牙窝充填势必会扰乱正常的拔牙愈合过程,其间利弊值得进一步深入研究与分析。

干槽症诊治流程建议

干槽症引起的疼痛剧烈,迁延数日,给患者带来极大痛苦。因此,除及时诊断、正确局部处置外,还应给予人文关怀。一方面,建议局部处置后配合口服镇痛药(如洛索洛芬钠胶囊),虽然干槽症的疼痛一般镇痛药物不能止痛,但是口服镇痛药可以给患者一定的心理安慰,并同时缓解局部处置后的疼痛不适。另一方面,建议患者两日内临床复诊,若患者因症状缓解而没有复诊,则建议医护人员电话随访,以便及时了解患者病情,避免不必要的医疗纠纷(图5)。

图5 干槽症诊治流程建议

作者简介

薛洋博士

薛洋,博士,陕西省优秀博士学位论文获得者,陕西省“住院医师规范化培训优秀带教老师”,陕西省口腔医学会口腔颌面外科学专委会秘书,陕西省口腔医学会口腔急诊专业委员会委员。副主编《标准拔牙助手操作图谱》、《拔牙就医指南》等专著2部,副主译《口腔外科小手术操作指南(第二版)》、参编/参译牙及牙槽外科相关专著6 部。辅导硕士/博士研究生10 名,主持国家自然科学基金1 项,以第一/通讯作者发表SCI论文11 篇,获得陕西省科学技术一等奖、二等奖各1 项,陕西省教学成果一等奖1项,邱蔚六口腔颌面外科发展基金“希望奖”。

干槽症的分类

干槽症的区别处理

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《自然》子刊综述:开发“不限癌种”疗法需要注意这些问题

《自然》子刊综述:开发“不限癌种”疗法需要注意这些问题

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上周,默沙东(MSD)公司的PD-1抑制剂Keytruda获得FDA批准,治疗肿瘤突变负荷高(TMB-H)的实体瘤患者,无需考虑癌症类型。这是Keytruda第二次获批“不限癌种”适应症。上个月,礼来(Lilly)公司开发的RET抑制剂Retevmo(selpercatinib)也获得加速批准上市,治疗携带RET基因融合和激活性突变的三种癌症类型。加上已经获得批准的TRK抑制剂Rozlytrek(entrectinib)和Vitrakvi(larotrectinib),目前已有4款“不限癌种”疗法获批上市

基于跨越多种组织类型的生物标志物开发创新疗法正在成为抗癌疗法开发的一个重要策略。那么,“不限癌种”疗法开发需要注意哪些问题?研发管线中又有哪些在研疗法?近日,Nature Reviews Drug Discovery上的一篇综述对这一研发领域进行了盘点。

开发“不限癌种”疗法需要注意的问题

药物活性的组织学特异性

“不限癌种”疗法的获批显然证明了这一药物开发策略的价值,然而,过去几年来从“不限癌种”疗法开发中获得的教训也表明,不同的组织之间在信号通路的相互作用方面存在很大差异。这意味着靶向同一信号通路的精准疗法在不同的组织中会表现出非常大的疗效差异。对药物活性的组织特异性评估将直接影响到疗法能否获得或维持“不限癌种”批准。

例如BRAF V600基因突变在不同组织中的功能有很强的异质性。这些突变会导致BRAF蛋白激酶的持续激活,从而促进肿瘤生长和血管增生。BRAF V600特异性酪氨酸激酶抑制剂vemurafenib和dabrafenib已经在携带BRAF V600基因突变的黑色素瘤和非小细胞肺癌(NSCLC)患者中表现出活性,并且获批治疗这些适应症。

然而,携带BRAF V600E突变的结直肠癌(CRC)患者对BRAF抑制剂单药疗法的响应欠佳。这是由于在CRC患者中,BRAF抑制导致EGFR信号通路的激活,这成为BRAF抑制剂耐药性的主要机制。而黑色素瘤表达的EGFR水平很低,因此这一反馈通路并没有影响到BRAF抑制剂的疗效。这一结果意味着在治疗携带BRAFV600E突变的CRC患者时,BRAF抑制剂需要与EGFR抑制剂联用,才能达到期望中的治疗效果。这一组合也在近日获得FDA批准

除了BRAF基因突变以外,对HER2阳性肿瘤的研究也显示出HER2过度表达在不同组织之间的差异。HER2过度表达出现在20-25%的转移性乳腺癌,和15-20%的转移性胃癌中。在乳腺癌领域,靶向HER2的多款抗体和抗体偶联药物已经展示了良好的临床活性,并且已经获得FDA的批准。在治疗胃癌方面,HER2靶向疗法虽然也表现出积极的活性,但是靶向疗法获得的疗效不如乳腺癌。这一区别的原因之一可能与HER2在乳腺癌和胃癌中的表达模式相关。HER2在乳腺癌中的表达相对更为均衡,而在胃癌中表达水平的异质性更高。

这些经验表明,即使基于跨越多种组织的共同信号通路开发“不限癌种”疗法,基于肿瘤组织来源的临床后果分析仍然必不可少。只有这样才能够确认在研疗法在不同组织中表现出的活性,并且捕捉到在研疗法对特定组织产生的活性。

图片来源:123RF

监管机构需要注意的问题

FDA基于早期临床试验结果,加速批准“不限癌种”疗法的先例表明,FDA在这类疗法的审评方面,基于有力的生物学机制和积极的疗效和安全性结果,表现出很高的灵活性。目前,美国、欧盟、加拿大、日本、和巴西的监管机构已经具备批准“不限癌种”疗法的监管通路。然而,不同监管机构对评估临床活性的标准并不统一。例如,欧盟EMA在美国FDA批准larotrectinib上市后7个月也批准该疗法上市,然而在考量这一批准时,使用的数据是基于102名患者的临床数据。美国FDA的加速批准是基于55名患者的临床数据。

能否获得“不限癌种”适应症批准,临床试验中注册的癌症种类的数目是一个很关键的因素。例如,支持Keytruda获批的临床试验中包含了15种癌症类型,而支持larotrectinib获批的研究包含了17种癌症类型,它们包含了常见和罕见的癌症类型。

然而即便如此,这些早期试验招募的患者无法代表所有携带微卫星不稳定性高(MSI-H)表型或NTRK基因融合的癌症患者。这一局限意味着上市后研究和观察的结果非常重要。如果在后续研究中,这些“不限癌种”疗法在特定癌症种类中表现不佳,那么监管机构应该对“不限癌种”适应症的批准做出什么样的修改,是监管机构需要考虑的问题。

潜在“不限癌种”疗法靶点

除了上面提到的NTRK基因融合,RET基因融合和突变,以及MSI-H和肿瘤突变负荷高的生物标志物以外。目前,多种其它生物标志物被用于开发“不限癌种”疗法,具体信息请见下表:

作者表示,目前,安进公司和Mirati Therapeutics公司靶向KRASG12C的KARS抑制剂都在治疗携带KRASG12C突变的NSCLC患者中表现出了良好的活性,然而在治疗携带KRASG12C突变的其它癌症类型中表现出的活性欠佳。这些试验仍然处于早期阶段,因此在现阶段根据评估这些KRAS抑制剂“不限癌种”的潜力为时尚早。

此外,在靶向HER2表达肿瘤方面,阿斯利康和第一三共联合开发的抗体偶联药物Enhertu近日连续获得FDA授予的突破性疗法认定,治疗表达HER2的NSCLC胃癌患者。在今年的ASCO年会上,Enhertu在治疗这些患者的初步临床数据也展现出了良好的疗效。虽然目前两家公司的临床试验设计是针对特定肿瘤类型,不过它们的研发计划中也将探索Enhertu作为“不限癌种”的HER2靶向疗法。

结语

综述的作者表示,随着我们对致癌的分子机制和免疫因素的进一步了解,基于分子生物学变化对肿瘤的重新分类正在开创一个“不限癌种”的药物开发新时代。这带来创新机遇的同时,也意味着我们需要克服多种挑战。

临床试验主方案(master protocol)方面的创新,尤其是篮子试验的应用,为“不限癌种”疗法提供了合适的统计学设计。然而,过去几年里开发生物标志物驱动药物的经验表明,特定精准疗法的活性可能存在组织特异性,这意味着“不限癌种”药物开发并不适用于所有未来肿瘤学药物。因此,无论是研究人员、医药公司、还是监管人员,都应该认识到“不限癌种”药物开发带来的新增复杂性和不确定性。

参考资料:

[1] Pestana et al. (2020). Histology-agnostic drug development—considering issues beyond the tissue. Nature Reviews Drug Discovery, https://doi.org/10.1038/s41571-020-0384-0

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