Cell背靠背 | 脑部恶性肿瘤微环境分析

Cell背靠背 | 脑部恶性肿瘤微环境分析

撰文 | 我的闺蜜老红帽责编 | 兮脑部恶性肿瘤(Brain malignancies)指的是在大脑中产生的肿瘤,比如胶质瘤(gliomas)和胶质母细胞瘤(glioblastomas),以及起源于其他部位,但是转移到脑部的肿瘤(brain metastases,简称BrMs),包括黑色素瘤(melanoma),乳腺癌和肺癌【1】。

对于胶质瘤来讲,异柠檬酸脱氢酶发生突变(isocitrate dehydrogenase,简称IDH mut)的病人情况相对较轻,若没有发生突变(IDH野生型),则较为严重,往往是已处于第四期的胶质母细胞瘤。

尽管病人罹患脑瘤后可以通过“手术治疗加放疗(radiation)或替莫挫胺(temozolomide )化疗标准”进行治疗【2】,但是,胶质瘤的生存率很低【3】,而BrMs生存率更低,甚至需要以月计算【4】。鉴于目前脑瘤的治疗效果不尽人意,学界开始认识到,广泛和深入的研究脑瘤是如何在所在的肿瘤微环境(brain tumor microenvironment,简称TME)中发生发展,很可能为肿瘤治疗提供新靶点和新的治疗手段【5】。

目前,免疫检查点阻断法(Immune checkpoint blockade,简称ICB),过继性免疫疗法(adoptive cell therapy)和疫苗是肿瘤的三大免疫疗法。当然,这些疗法还远达不到完美,究其原因,除了肿瘤细胞的内在因素外,脑瘤微环境中的免疫抑制性因素,包括肿瘤相关的巨噬细胞(Tumor-associated macrophages,简称TAMs)也发挥了重要作用【6,7】。

小鼠系谱追踪实验(Lineage-tracing experiments)显示,脑部TAM可以分为两类,一是来源于组织驻留的小胶质细胞,二是由外周循环系统募集的单核细胞来源的巨噬细胞(monocyte-derived macrophages,简称MDMs)。这些细胞可以整合肿瘤发生发展不同阶段的细胞因子,生长因子以及一些刺激因素等信息并产生相应应答。但是,这两类TAM,以及其他肿瘤微环境中的免疫细胞,究竟对人类脑瘤发生发展起到何种作用,仍旧不得而知。

2020年5月28日,来自瑞士洛桑大学的Johanna Joyce研究组在Cell杂志上发现题为Interrogation of the Microenvironmental Landscape in Brain Tumors Reveals Disease-Specific Alterations of Immune Cells的文章,通过多种实验手段系统性分析低级/高级胶质瘤和BrMs的肿瘤微环境,发现不同类型的脑瘤,其肿瘤微环境中不同免疫细胞的富集和应答也截然不同。

首先,作者分析了脑瘤微环境中的免疫细胞。作者的研究对象来源于100余个临床样本,包括正常脑部组织和低级胶质瘤,高级胶质瘤以及黑色素瘤,乳腺癌和肺癌来源的BrMs等脑瘤组织,并重点分析了14类主要免疫细胞。

作者发现,肿瘤组织中的髓样细胞(myeloid cells)水平要远高于正常组织。并且,综合分析14类免疫细胞的水平,可以将上述组织分为3类:

第一类,正常组织和IDH突变胶质瘤,主要由小胶质细胞和少量免疫细胞组成。第二类,IDH野生型胶质瘤和一些BrMs,富集MDMs和一些中性粒细胞。第三类,绝大部分的BrMs和一小部分胶质瘤,免疫细胞种类非常丰富,并伴随T细胞和中性粒细胞的浸润。

上述这些结果说明,小胶质细胞、巨噬细胞、中性粒细胞和T细胞是脑瘤微环境中主要的免疫细胞类型。接下来,作者就上述几种细胞类型进行具体分析。作者发现,肿瘤微环境中各细胞的转录谱变化与肿瘤类型以及肿瘤位置都相关。作者按照肿瘤类型(胶质瘤,BrM)和细胞类型(小胶质细胞和巨噬细胞)这两个变量将数据分为4组。

首先针对各肿瘤组织的共性进行分析,发现与正常组织相比,肿瘤组织的小胶质细胞和巨噬细胞的应答主要集中在下面三个方面:第一,肿瘤微环境,包括血管增生(Angiogenesis)和低氧(Hypoxia)。第二,炎症。第三,免疫细胞活化,包括TNF⍺信号通路,Interferon ⍺信号通路,Interferon r-IL2-STAT5信号通路和IL6-JAK-STAT3信号通路等。

再下来,作者分析各种细胞在不同肿瘤组织中的差异,发现I型干扰素信号通路在BrM的胶质细胞和巨噬细胞,以及胶质瘤中的巨噬细胞中发生活化,而在胶质瘤中的小胶质细胞中却没有。而胶质瘤和BrM的巨噬细胞都出现TH17相关应答以及与其他免疫细胞的作用。这些结果都说明,脑瘤微环境中小胶质细胞和巨噬细胞存在富有层次的活化状态。最后,作者集中分析胶质瘤这一脑瘤类型。作者发现,在胶质瘤中,小胶质细胞和巨噬细胞处于不同的位置,巨噬细胞更接近CD31+血管结构。作者还比较了IDH突变以及IDH野生这两类胶质瘤,发现巨噬细胞在这两类脑瘤中的表现截然不同,并且,肿瘤微环境有助于IDH野生型胶质瘤细胞胞外基质的构建和发挥功能。这份工作采用高深度,多组学的方法来研究分析肿瘤微环境,并且还比较了胶质瘤和BrM两种脑瘤,发现和确定肿瘤微环境中的免疫细胞类型和状态取决于肿瘤的来源以及IDH是否发生突变。

与此同时,来自瑞士苏黎世大学的Burkhard Becher研究组在同一期Cell杂志上背靠背发表题为Single-Cell Mapping of Human Brain Cancer Reveals Tumor-Specific Instructionof Tissue-Invading Leukocytes的文章,同样分析了脑瘤微环境的免疫细胞差异,得到了十分类似的结论

这两篇文章的区别集中在研究方法上。Johanna Joyce研究组综合了流式细胞术,RNA测序技术,免疫荧光以及酶联免疫印记实验等传统细胞生物学研究方法,而Burkhard Becher研究组则主要采用最新的单细胞测序(high-dimensional single-cell profiling,简称CyTOF)。异曲同工,殊途同归。

原文链接:https://doi.org/10.1016/j.cell.2020.05.007https://doi.org/10.1016/j.cell.2020.04.055 参考文献[1]Cagney, D.N., Martin, A.M., Catalano, P.J., Redig, A.J., Lin, N.U., Lee, E.Q., Wen, P.Y., Dunn, I.F., Bi, W.L., Weiss, S.E., et al. (2017). Incidence and prog- nosis of patients with brain metastases at diagnosis of systemic malignancy: a population-based study. Neuro-oncol. 19, 1511–1521.

[2]Stupp, R., Mason, W.P., van den Bent, M.J., Weller, M., Fisher, B., Taphoorn, M.J., Belanger, K., Brandes, A.A., Marosi, C., Bogdahn, U., et al.; European Organisation for Research and Treatment of Cancer Brain Tumor and Radio- therapy Groups; National Cancer Institute of Canada Clinical Trials Group (2005). Radiotherapy plus concomitant and adjuvant temozolomide for glio- blastoma. N. Engl. J. Med. 352, 987–996.

[3]Aldape, K., Brindle, K.M., Chesler, L., Chopra, R., Gajjar, A., Gilbert, M.R., Got- tardo, N., Gutmann, D.H., Hargrave, D., Holland, E.C., et al. (2019). Challenges to curing primary brain tumours. Nat. Rev. Clin. Oncol. 16, 509–520.

[4]Ceccarelli, M., Barthel, F.P., Malta, T.M., Sabedot, T.S., Salama, S.R., Murray, B.A., Morozova, O., Newton, Y., Radenbaugh, A., Pagnotta, S.M., et al.; TCGA Research Network (2016). Molecular Profiling Reveals Biologically Discrete Subsets and Pathways of Progression in Diffuse Glioma. Cell 164, 550–563.

[5]Klemm, F., and Joyce, J.A. (2015). Microenvironmental regulation of therapeu- tic response in cancer. Trends Cell Biol. 25, 198–213.

[6]Gutmann, D.H., and Kettenmann, H. (2019). Microglia/Brain Macrophages as Central Drivers of Brain Tumor Pathobiology. Neuron 104, 442–449.

[7]Quail, D.F., and Joyce, J.A. (2017). The Microenvironmental Landscape of Brain Tumors. Cancer Cell 31, 326–341.

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学术争鸣 | 从迷雾重重到柳暗花明?全面起底DNA 6mA修饰相关研究的争议

学术争鸣 | 从迷雾重重到柳暗花明?全面起底DNA 6mA修饰相关研究的争议

编者按:围绕DNA新修饰6mA的争议巨大,BioArt编辑部在广泛听取了十多位海内外专家的意见的基础上专门对整个研究历程以及争议进行了回顾和描述,本着对科学负责的态度,BioArt编辑部保持了最大的独立性完成此文,全文8000多字,历时一年左右完成。尽管争议还在继续,但是相信这篇文章对关心和希望了解6mA领域的读者有一定的帮助,至于是非曲直,留给读者去思考和判断。

撰文 | 小柚

责编丨丁广进

DNA甲基化是最早被发现,也是目前研究最深入的表观遗传调控机制之一。哺乳动物中最主要的DNA修饰是5mC(5-甲基胞嘧啶),占人类DNA中总胞嘧啶的3%~6%【1】。相反,5mC在原核生物中很少,而6mA(N6-甲基腺嘌呤,对应RNA上的修饰成为m6A,请读者注意区分)则是原核生物中最具代表性的DNA修饰,主要参与限制-修饰系统(restriction-modification),保护个体免受外来DNA的侵入。

尽管哺乳动物中缺乏已知的限制-修饰系统,但近年来的研究在真核生物,甚至包括哺乳动物和植物基因组中鉴定到了6mA,并发现6mA在生长发育和疾病调控中具有重要作用。这些研究掀开了真核生物表观遗传修饰的新篇章。

但同时,随着关注的增加,不同的声音也不断被发出,一场围绕真核生物中DNA 6mA修饰的相关争议早已拉开帷幕,而最为激烈的是关于哺乳动物基因组中是否存在6mA的争议。

一、 “繁花似锦”——真核生物中6mA的鉴定历程

2015年,Cell连发3篇研究(入选当期Cell杂志的封面论文),首次报道藻类【2】、果蝇【3】和线虫【4】的基因组中具有6mA修饰, 并配同期评论“An Adenine Code for DNA: A Second Life for N6-Methyladenine【5】”,认为真核生物中6mA的发现,将赋予6mA研究的第二次生命。

Cell杂志的封面。Image design by Lena Kay.

仅过去一年,2016年Nature发表研究报道6mA在小鼠胚胎干细胞中存在,并参与转座子活性的调控,同时鉴定了ALKBH1为6mA去甲基化酶【6】

6mA在真核生物中的鉴定研究,不少论文登上Top期刊,足以说明6mA带来的惊喜和受到的巨大关注。

随后,越来越多的研究团队加入6mA研究。

2018年7月,Molecular Cell发表利用SMRT测序首次获得人类细胞的DNA 6mA修饰图谱的研究,证明6mA在人类基因组(包括线粒体基因组)中广泛存在,并且癌组织中6mA的丰度显著低于正常组织,同时鉴定了N6AMT1为6mA甲基化酶【7】。(详见BioArt报道:

)。

4个月后,Cell发表6mA在神经胶质瘤中的研究,发现6mA在脑癌干细胞中的含量高于正常神经组织,并且靶向6mA去甲基化酶ALKBH1有望成为治疗该类癌症的新策略(详见BioArt报道:

【8】

同时,植物6mA研究也在如火如荼的进行,势头不亚于6mA在人类中的研究。2017年,水稻和拟南芥基因组中6mA修饰图谱于2018年分别发表在Nature Plant【9】Molecular Plant【10】Development Cell【11】

不仅科学研究者们看到了6mA的潜力,多家测序公司也嗅到商机,声称可开展6mA测序鉴定服务,绘制特定体系中的6mA图谱 。

参考RNA m6A被证明广泛存在于mRNA并参与多项生命活动进程后的火热程度,许多研究同行预见DNA 6mA可能将成为表观遗传领域的热门新领域!

二、“针锋相对”——6mA的鉴定争议

虽然6mA在高等真核生物中的研究看起来花团锦簇,但我们仍然难以绘制6mA分布图谱和了解它的生物学意义,这是因为不同研究中6mA的丰度,分布和功能在有巨大差异。在植物和真菌中,6mA主要富集在基因转录起始区,与转录激活有关,丰度在0.05%至2.8%【2,11】。在脊椎动物中,6mA主要富集在转座子区【6】、异染色质区【8】甚至基因编码区【7】;而6mA的丰度在不同哺乳动物和组织中竟相差10000倍(0.0001%~1%)【7, 8,12-14】

这些差异,特别是6mA的丰度差异,是由于物种或组织特异性造成的?还是由于实验手段和方法的差异造成的?当6mA的丰度为0.0001%时,相当于每百万个腺嘌呤核苷酸(A)仅有10个携带6mA修饰,这样低的丰度,真的具有生物学功能吗?是否是检测时的污染?

关于真核生物是否真的具有6mA修饰,学界一直存有争议。

Schiffers SRatel D等分别在Angew Chem Int Ed Engl【9】FEBS Lett【10】发表研究直言小鼠中不存在6mA修饰。但这两项研究并未引起太大关注。

2019年6月,波士顿儿童医院的Eric L. Greer 博士在BMC Genomics发表研究 “Sources of artifact in measurements of 6mA and 4mC abundance in eukaryotic genomic DNA”,该研究发现由于检测技术中存在污染,目前大部分研究都高估了真核生物中6mA和4mC的含量

质谱检测(UHPLC-MS/MS,ultra-high performance liquid chromatography tandem-mass spectrometry)是各类修饰鉴定的金标准。在DNA 6mA的质谱检测中,需要使用核酸酶和磷酸酶将待检测DNA消化成单个脱氧核苷酸分子,而目前使用最广泛的核酸酶和磷酸酶都来源于细菌。细菌中含有高丰度的6mA,这可能使这些酶携带6mA。

确实,研究者检测了目前市面上3款常见的核酸酶和磷酸酶:Nuclease P1,Nuclease S1和DNA degradase plus,发现它们均含有6mA修饰的污染。当采用这些酶处理的水作为对照,并将其中6mA含量设置为背景值时,研究者发现包括线虫(这也提示研究人员,基于线虫体系围绕6mA开展的进一步深入研究所得出的结论【19】也需要重新审视),小鼠和人在内的多个物种,6mA含量非常低,甚至检测不到(< 0.00003% for 6 mA)。

这说明6mA在某些哺乳动物中的高丰度,是由细菌污染造成的;当排除细菌污染后,6mA在哺乳动物中的含量非常非常低。(值得注意的是,该研究的通讯作者Eric L. Greer之前是施扬教授的博士后,也是2015年在Cell线虫中6mA鉴定研究的第一作者。虽然BMC Genomics杂志的影响因子不高,但该研究的作者中有施扬和何川两位领军人物的名字,足以说明他们对该研究提及的细菌污染问题的重视。)

此外,今年3月,来自瑞典林雪平大学的Colm E. Nestor教授在Science Advance发表研究“No evidence for DNA N6-methyladenine in mammals”,通过多种检测方法,严格的对照设置和分析,对6mA在基因组中的存在进行了全方位否定。基于6mA抗体的Dot blot和DIP-seq,质谱和基于测序方法的SMRTseq(根据甲基化修饰会影响DNA合成速度间接反应6mA的含量)是6mA检测的最常用方法。

其中,Dot blot和DIP-seq的准确性主要依赖6mA抗体的特异性。研究者采用全基因组扩增DNA(whole genome amplification DNA,WGA DNA,经PCR产生,无6mA修饰)作为阴性对照,检测了多种组织和细胞系中6mA的含量。经检测,它们的6mA Dot blot强度与WGA DNA(阴性对照)相当,提示6mA的含量很低。

研究者进一步分析了已发表的6mA位点和丰度研究,发现即使是相同的组织或细胞,DIP-seq和SMRTseq检测到的6MA位点仅1~8%重合,质谱检测到的6mA含量更是相差10~1000倍,说明这些6mA的差异是课题组的不同造成的,而不是其本身的差异。总的来说,该研究认为迄今发表的研究无法支持哺乳动物基因组中存在6mA修饰或者有高丰度。

三、 “峰回路转”——6mA在哺乳动物基因组中存在,但却不是表观遗传标记(epigenetic mark)

6mA在人类基因组中的丰度差异,促使研究者们开发更精确,稳定和无污染的质谱方法鉴定6mA的含量。

今年3月,来自德国IMB的Christof Niehrs教授在Nature Chemical Biology【11】发表文章发现,哺乳动物基因组中的6mA含量很低(每百万个A中仅6~13个携带6mA修饰),并且这些6mA并不是由甲基化酶催化的,而是来自m6A RNA的甲基分解代谢和再利用,由DNA聚合酶将携带6mA的核苷酸整合到基因组中。

Nature Chemical Biology同期配了来自英国牛津大学的Paolo spingardi和skirmantas Kriaucionis对该研究的评论“How m6A sneaks into DNA”。他们指出,DNA修饰的低丰度,并不能成为我们质疑其生物学功能的论据,但是当某种修饰的含量非常稀有时(例如6mA在哺乳动物基因组中的含量),就可能使其在细胞中的功能受到挑战

并且,6mA通过核酸代谢回收途径被整合到基因组中,使得它难以成为一种表观遗传标记。对于在哺乳动物中具有重要功能的DNA 5mC修饰,细胞有一套机制严格地限制来自核酸分解代谢产生的5mC掺入基因组中,以确保其精确的定位。而6mA掺入基因组似乎没有被限制,这提示6mA本身的分布(在基因组上的精确定位),可能并不重要。

4月,中国科学院的汪海林教授(2015年与陈大华教授合作在Cell发表果蝇中DNA 6mA鉴定研究)在Cell Research也发文报道6mA通过DNA聚合酶X家族成员非模板依赖的Polyλ掺入基因组中【12】。在体外实验中,研究者将N6mdATP代替部分dATP与高保真DNA聚合酶Taq(模板依赖的聚合酶)共同孵育,发现6mA可被掺入PCR反应中;而当N6mdATP与dATP的比例降低至1:1000时,PCR产物中则检测不到6mA,这说明N6mdATP并不是一种友好的DNA合成底物,且高保真Taq酶更倾向于使用dATP而非N6mdATP

而在细胞周期的G1期,非模板依赖的Polyλ将6mA核苷掺入基因组;敲低Polyλ可显著降低G1期和sub G1期6mA的水平。同时,研究者利用CRISPR敲除潜在的6mA甲基转移酶METTL4和去甲基酶ALKBH1后(关于催化DNA 6mA的酶目前并没有定论,还处于争议之中),发现UPHLC-MS/MS分析方法并不支持它们是6mA相关催化酶,因为6mA的水平均未发生明显变化(详见BioArt报道:

)。值得注意的是,该研究未发现DNA 6mA可通过RNA m6A代谢掺入,与前述Nature Chemical Biology论文中的结论相左。因此,关于基因组中低丰度的6mA来源,还需进一步的研究。

四、柳暗花明?6mA作为表观遗传标记参与线粒体生命活动的调节

目前6mA的研究不仅仅是它本身的鉴定和功能研究,更涉及到了6mA甲基化酶和去甲基化酶的鉴定,并且敲低或过表达这两类酶,也成为研究6mA功能的重要手段。如果6mA在基因组中的含量很低,那么这些酶在细胞中的真实底物是什么呢?

事实上,关于6mA的甲基化酶和去甲基化酶,学界也颇多争议。

2016年,Andrew Z. Xiao教授在小鼠中鉴定ALKBH1为6mA去甲基化酶【6】。2018年,晏光荣肖传乐教授则鉴定了N6AMT1作为人的6mA甲基化酶【7】。而谢琦教授等以神经胶质瘤为模型,发现N6AMT1并不具有6mA甲基化酶活性,而ALKBH1具有去甲基化酶活性(该研究为谢琦,Jeremy N. rich和Andrew Z. Xiao两方课题组合作完成)【8】

2019年,南加州大学医学院的Douglas E. Feldman教授将METTL4和ALKBH4分别鉴定为6mA修饰的甲基化酶和去甲基化酶(但是并没有提及N6AMT1和ALKBH1)(详见BioArt报道:

)。

今年2月,清华大学的李海涛教授和Andrew Z. Xiao教授,中国农业大学的陈忠周教授与中科院生物物理所闫小雪分别在Cell Research发表研究,解析了ALKBH1作为哺乳动物DNA 6mA去甲基化酶的自由态以及与DNA底物结合后的复合物结构及工作机制(详见BioArt报道:

Cell Research背靠背 | 李海涛、陈忠周团队分别发文揭示哺乳动物中DNA 6mA去甲基化酶ALKBH1的工作机制​mp.weixin.qq.com

)。

蛋白结构是功能的基础,结构解析往往为我们了解蛋白提供了“眼见为实”的证据。由此,虽然6mA甲基化酶尚存争议,但似乎ALKBH1是6mA去甲基化酶,至少在体外实验中证明ALKBH1是6mA去甲基化酶。而6mA在哺乳动物基因组中的含量非常稀少,ALKBH1作为去甲基化酶,能发挥多大的生物学功能呢?一时间,疑问更多了。

今年3月,芝加哥大学的何川教授在Molecular Cell发表的研究为6mA研究提供了新的方向【15】(详见BioArt报道:

)。该研究发现哺乳动物中的6mA修饰主要集中在线粒体DNA上(平均每个mtDNA分子有4个6mA),而核基因组DNA的6mA量极低。同时,研究者鉴定了主要定位在线粒体中的METTL4,是6mA的甲基转移酶(这与南加州大学医学院的Douglas E. Feldman教授的结论一致,但他们当时认为METTL4介导核基因组的6mA修饰。

但是该结果与最近施扬教授团队发表在Cell Research上的结果相左,施扬团队证明METTL4催化的底物是RNA而不是DNA)。6mA阻碍线粒体转录因子结合mtDNA,从而减弱mtDNA的转录和拷贝数(mtDNA copy number)。在低氧情况下,6mA的水平上升,提示6mA与线粒体压力应答过程相关。

那么,ALKBH1是否定位在线粒体中并发挥mtDNA 6mA去甲基化酶的功能呢?已有研究表明ALKBH1可以定位在线粒体中,功能包括调控线粒体tRNAMet的2’-O-甲基化【15】,线粒体RNA granule的形成【16】和拷贝数【17】等。而关于ALKBH1是否调控mtDNA 6mA尚不清楚。

综上,关于N6AMT1和ALKBH4,ALKBH1的功能,它们真正的催化底物,都需要进一步研究。

五、雄关漫道真如铁,而今迈步从头越

从2015年首次在真核生物中被鉴定到如今5年多的时间里,6mA获得了广泛的关注,也引发了激烈的争议。我们对6mA的态度也从期待变成了审慎。6mA在哺乳动物中的低丰度,与其高度的动态性有关吗?由DNA聚合酶掺入的6mA是随机分布的吗?是否具有生物学功能?目前鉴定的m6A相关催化酶,是真实的吗?

目前的表观遗传研究为我们回答这些问题,提供了一些线索,当然也引发新的疑问。

1)6mA的高度动态性;

在果蝇胚胎中,6mA的丰度在胚胎发育的0.75h内达到顶峰(~0.07%,6mA/dA),而后迅速降低,4h后仅剩~0.001%【3】,另外两篇文章也提到了斑马鱼的猪的胚胎发育过程以及小鼠应对环境变化中DNA 6mA具有高度动态性【20,21】,由此可见,6mA的丰度呈高度动态性,对其鉴定也需要把握时机。

而目前哺乳动物中6mA的鉴定多集中HeLa,HEK293T和mES等有限的细胞系中,这可能导致无法真实反应6mA在哺乳动物中的丰度。因此,为更准确的了解哺乳动物中6mA的含量,还需扩大检测范围(如检测各发育时期中6mA的丰度)。

2)单一位点的单个修饰也有大功能;

虽然有关6mA的丰度尚存争议,但是高精度质谱检测已提示6mA在哺乳动物中的含量非常有限,这也为6mA的生物学功能画了问号,丰度低就说明没有什么大功能吗啊?那么,表观遗传修饰的丰度和生物学功能间是怎样的关系呢?

今年5月,澳大利亚新南威尔士大学的Merlin Crossley 教授在Nature Communication发文“Methylation of a CGATA element inhibits binding and regulation by GATA-1”【18】,该研究发现c-kit基因座位的单个5mC甲基化位点就足以影响转录因子GATA-1对该基因座位的结合,并调控造血系统的正常发育

这从某种程度上说明低丰度的表观遗传修饰也可通过影响某一生物过程的关键基因而发挥巨大作用。因此,为探索6mA的生物学功能,开发可信赖的6mA分布位点检测方法是十分必要的。

六、关键论文作者的回应

6mA研究出现了很多的争议和讨论,Bioart联系上述研究中的多位相关人士了解他们对于该领域的看法,有永远不信的、有将信将疑的、有绝对相信的,当然还有一直观望看戏的。此外,BioArt特别邀请了两位直接参与实验的关键论文第一作者Tao P. Wu博士和Eric L. Greer博士,谈谈他们对6mA的鉴定和相关催化酶的看法。

Tao P. Wu博士(现在贝勒医学院人类与分子遗传系建立实验室)早前在耶鲁大学的Andrew Z. Xiao教授实验室做博后,是6mA在小鼠胚胎干细胞中的鉴定和发现ALKBH1是6mA去甲基化酶的研究的第一作者【6】,同时也是2018年Cell论文(6mA修饰与胶质瘤)的共同第一作者【8】Tao P. Wu博士关于小鼠ESC中6mA含量低和受质谱中核酸酶的污染等问题做出了回应:

“虽然越来越多的证据显示m6dA是哺乳动物中一种功能性的DNA表观修饰,但是仍然有来自阴性结果的质疑,需要进一步探讨。在我们发表第一篇Nature文章之后,德国的Thomas Carell研究小组发文声称在wild-type mouse ES cell 中检测不到m6dA (with UPLC-MS/MS)。读者如果熟悉干细胞研究相关背景的话,应该很清楚小鼠干细胞的培养有多种条件与方法,其中尤其以培养基对细胞状态的影响最大。

Andrew Z. Xiao实验室正在撰文,描述它们对DNA修饰的影响。最近,Eric Greer小组(postdoc in Yang Shi Lab before)又发表结果,声称DNA digestion enzyme含有来自细菌DNA 的污染。这在我们和其他几个实验室做UPLC-MS/MS检测的时候,都没有发现类似的结果;相关的对照实验结果我们也会放在未来的文章当中。

对于SMRT Sequencing, Shijia Zhu & Gang FangGenome Research文章中已经进行过讨论(Nat Rev Genet发表房刚组细菌表观组综述论文),在m6dA丰度极低的情况下,SMRT 会产生假阳性结果。这也正是为什么,该领域亟需新的方法和研究模型。最近,肖传乐 & Kai Wang发表文章,尝试了利用机器学习算法分析Nanopore sequencing数据来读取DNA修饰信息。Tao P. Wu实验室也在开发新的方法,拓展新的研究模型。”

Eric L. Greer博士早前是施扬教授的博士后,鉴定了线虫中的6mA【4】,并发现哺乳动物的6mA可能来源于核酸酶的污染。Eric L. Greer博士目前在哈佛医学院独立开展研究工作,就目前鉴定的6mA相关催化酶的看法如下:(原文附在译文之后)

“就哺乳动物6mA催化蛋白的酶活性而言,这些蛋白都是我们之前在线虫中鉴定的6mA相关催化酶的同源蛋白。我们在体外条件下得到的酶活性不能真实反应生理条件下该酶的催化活性,但是实验间的平行性差(当我们有关线虫中6mA及相关催化蛋白的文章出来时,我们已鉴定了哺乳动物中6mA催化酶,只是这些结果太初步了)。

这可能是由于我们未得到最佳的酶反应条件,也可能这些酶有其他的更主要的作用底物,而当过表达它们到过高的浓度时,它们也可以完成N6位的甲基化和去甲基化过程。如果这些酶最主要的底物是其他物质(比如RNA或者其他DNA修饰),当在某一体系中过表达超高浓度的你感兴趣的蛋白,来迫使它们发挥功能时,你可能被结果所欺骗,认为找到了正确的底物。这就是为什么进行酶活性动力学实验非常重要,这有利于确认它们在生理条件下的活力。”

以下为邮件原文:In terms of the enzymatic activity of the mammalian proteins these have all been identified as homologues of proteins that we identified in C. elegans. We have found that we get spurious activity of these proteins in vitro but it is not consistent from experiment to experiment (we had actually identified the mammalian proteins at the same time when our C. elegans story came out but thought they were too preliminary). This could reflect that the enzymatic conditions are not optimal or that these enzymes have another primary substrate and when forced in excessive concentrations to methylate or demethylate N6 on adenosine they will. If the primary target of the enzyme is something else (say RNA or another DNA modification) you can still force activity by overloading the system with really high concentrations of your enzyme of interest and trick yourself into thinking that it is the right target. That is why it is important for showing methylases and demethylases to perform kinetic experiments to determine whether the enzymatic activity would be physiologically relevant.)

实际上,不仅是6mA相关催化酶,包括目前最受关注的RNA m6A修饰,其去甲基化酶FTO的身份也经历了多次质疑和反转(详见BioArt报道:

NCB | 这一次,FTO是snRNA的m6Am去甲基化酶 )。由此可以看出,甲基化酶和去甲基化酶可能同时存在多种催化底物,比如FTO可同时介导m6A和m6Am去甲基化,解析其生理条件下最主要的催化底物才是关键。

此外,BioArt编辑部也注意到在国家自然科学基金中,有235万元的项目涉及6mA,包括6mA在植物和动物中的多项研究。鉴于6mA的争议和其在线粒体稳态维持的功能,今后的研究需秉持更加严谨和科学的态度,为我们揭开高等生物中6mA的全貌。

编后记:对于争议领域来说,正常的学术讨论是非常有必要的,讲究“有一份证据说一分话”,最好做到不打棍子,不扣帽子。新兴领域出现争议是再所难免的,面临争议就需要更多的研究同行携手探求科学的本质,努力就本领域的问题达成共识,良性的学术讨论环境才能促进领域扎实的向前发展。

BioArt特别提醒有兴趣研究DNA 6mA生物学功能的实验室,从事DNA 6mA有较高的门槛,目前除了高灵敏度的质谱技术(排除了可能污染)以外,基于抗体、三代测序的技术都存在很大的不确定性,再者围绕6mA修饰的相关酶类也存在极大的争议,因此,围绕6mA开展生物学功能研究的时候都需要采取审慎的态度,切勿盲目跟风下结论。

围绕6mA修饰的讨论还会持续下去,就这个话题BioArt也非常欢迎相关专家来稿发表不同的观点和意见。上述文章也并未对每一篇相关文章都进行了展开,限于学识和水平,文中错误疏漏之处在所难免,还请读者包容!

编者特别感谢一年多来,何川(芝加哥大学)、施扬(哈佛医学院)、陈大华(中科院动物所)、李海涛(清华大学)、伊成器(北京大学)、杨运桂(中科院基因组所)、汪海林(中科院生态环境研究中心)、房刚(美国西奈山医学院)、蓝斐(复旦大学)、吴涛(贝勒医学院)、谢琦(西湖大学)、刘颖(北京大学)、骆观正(中山大学)、陆发隆(中科院遗传发育所)、沈立(浙江大学)、Eric L. Greer(哈佛医学院)等多位专家就DNA 6mA修饰相关研究坦诚地提供相关信息和个人观点,部分专家审阅全文并提出了宝贵意见。

制版人:玉壶

参考文献

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dCAS9-VP64_GFP (Plasmid #61422)

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Plasmid 61422

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Backbone

Growth in Bacteria

  • Ampicillin

  • 37°C

  • Stbl3

  • none

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Gene/Insert

  • dCAS9(D10A,H840A)-VP64_2A_GFP

  • Synthetic; S. pyogenes

  • D10A and H840A in Cas9

  • Promoter
    EF1A

Cloning Information

  • Cloning method
    Restriction Enzyme
  • 5′ cloning site
    BsiWI
    (not destroyed)
  • 3′ cloning site
    EcoRI
    (not destroyed)
  • 5′ sequencing primer
    GTT TGG ATC TTG GTT CAT TCT CAA GCC TCA G
  • 3′ sequencing primer
    cacatagcgtaaaaggagcaacatag
  • (Common Sequencing Primers)

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Depositor Comments

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Information for Concentrated Lentiviral Prep (Catalog # 61422-LVC)

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Purpose

Ready-to-use Concentrated Lentiviral Prep particles produced from dCAS9-VP64_GFP (#61422). In addition to the viral particles, you will also receive purified dCAS9-VP64_GFP plasmid DNA.

Delivery

  • Volume
    50 µL
  • Titer
    ≥2.5×10⁶ TU/mL
  • Pricing
    $150 USD for preparation of 50 µL virus + $30 USD for plasmid.
  • Storage
    Store at -80℃. Thaw just before use and keep on ice.
  • Shipment
    Viral particles are shipped frozen on dry ice.
    Plasmid DNA (≥ 200ng) will also be included
    in the shipment.

Viral Production & Use

  • Packaging Plasmids
    psPAX2 (plasmid #12260)
  • Envelope
    pMD2.G (plasmid #12259)
  • Buffer
    PBS
  • Selectable Marker
    GFP
  • Purification
    Lentivirus was harvested from cell culture medium (DMEM + 10% FBS). Lentiviral particles were then collected by precipitation in polyethylene glycol (PEG) followed by centrifugation. Precipitated pellets containing viral particles were resuspended in PBS.

Biosafety

Requestor is responsible for compliance with
their institution’s biosafety regulations.
Lentivirus is generally considered BSL-2. AAV is
generally considered BSL-1, but may require
BSL-2 handling depending on the insert.
Biosafety Guide

Resource Information

Viral Quality Control

Titering Method:

Notes:

  • Quality control was performed on this lentiviral preparation prior to concentration. Results and explanations of quality control methods can be seen in the Information for Lentiviral Prep section on this page.

Visit our viral production page for more information.

How to cite this plasmid

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These plasmids were created by your colleagues. Please acknowledge the
Principal Investigator, cite the article in which the plasmids were described,
and include Addgene in the Materials and Methods of your future publications.

  • For your Materials & Methods section:

    dCAS9-VP64_GFP
    was a gift from

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    For viral preps, please replace (Addgene plasmid # 61422)
    in the above sentence with:

    (Addgene viral prep # 61422-LVC)

  • For your References section:

    Genome-scale transcriptional activation by an engineered CRISPR-Cas9 complex.
    Konermann S, Brigham MD, Trevino AE, Joung J, Abudayyeh OO, Barcena C, Hsu PD, Habib N, Gootenberg JS, Nishimasu H, Nureki O, Zhang F.
    Nature. 2014 Dec 10. doi: 10.1038/nature14136.
    10.1038/nature14136


    PubMed 25494202

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泰热I代 TALE-VP64人工转录激活因子–用于基因过表达–特别适合大基因(>3k)研究

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        可用于任意目的基因的过表达,特别是3k以上的大基因。VP64是一个转录激活结构域,TALE-VP64结合到目的基因启动子序列上以后可以增强目的基因的转录水平来增加目的基因表达。用TALE-VP64来进行过表达的优点:         1:可用于细胞内任意基因的过表达,所过表达的对象是细胞内源性的基因,没有其它的修饰和副产物的出现;         2:不受克隆和模板的限制,周期短,而有一些基因比如大基因,高GC含量基因,它们的克隆往往是很困难的;         3:不同的过表达TALE-VP64载体的表达增强效果会有差异,可以用来做表达强度效应的实验,得到目的基因激活程度不同工具或细胞群体。也可以通过结合不同TALE-VP64分子协同作用提高转录水平。A,B,C,D分别代表设计的4种用于过表达的TALE-VP64人工转录因子,A+D为同时转染两者,在293细胞中同时转染4种质粒可以激活基因表达10000多倍。Perez-Pinera P et al. Synergistic and tunable human gene activation by combinations of synthetic transcription factors. Nat Methods. 2013 Mar;10(3):239-42.用TALE人工转录因子过表达miRNA,紫色代表转录激活域为P65,绿色部分为VP64,miR1代表转染用于过表达的1号质粒,依次类推。将所有质粒同时共转染可以增强miRNA过表达250倍以上。Maeder ML et al. Robust, synergistic regulation of human gene expression using TALE activators. Nat Methods. 2013 Mar;10(3):243-5.服务内容:针对目的基因设计并构建一套4个TALE-VP64载体,提供给客户50ug质粒实物及测序结果和报告。载体选择:我们提供带有不同荧光表达的载体用于构建,另有带有抗性载体可以进行筛选。

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粘接修复的失败和提示——姜婷教授

粘接修复的失败和提示——姜婷教授

原创 今日口腔 中国医学论坛报今日口腔 4月24日

粘接修复是一种常用的口腔修复治疗方式,本文从典型的粘接修复方式入手,详细介绍各类粘接修复失败的表现和对临床工作者的提示。

作者:姜婷

北京大学口腔医院 

典型的粘接修复

典型的对牙体缺损和牙列缺损的口腔粘接修复包括粘接在牙釉质表面的全瓷贴面(唇贴面、舌贴面和贴面)和粘接固定义齿(粘接桥),粘接在牙本质表面的玻璃纤维增强树脂桩核以及全冠,同时粘接在牙釉质和牙本质表面的嵌体修复、高嵌体修复和部分冠修复等。

 全瓷贴面   通过使用全瓷贴面可以很好地修复前牙间隙(图1)、牙釉质发育不全(图2)、异色牙等美学缺陷。

图1 二硅酸锂增强热压铸造玻璃陶瓷贴面关闭牙间隙

图2 全瓷贴面修复牙釉质发育不全

 粘接固定义齿   对于前牙缺失、两侧基牙因牙周病而松动的患者,使用玻璃纤维增强的复合树脂材料,通过夹板式粘接固定义齿的修复方式,不但可以恢复缺失牙的功能,改善美观效果,而且对两侧松动的基牙可以起到固定的作用,如果患者还存在牙龈退缩的问题,还可以使用牙龈色树脂进行软组织的修复,提高美学效果(图3)。

图3 玻璃纤维增强瓷化树脂夹板式粘接桥修复下颌前牙缺失

 高嵌体修复   对于根管治疗后的牙齿,与传统的桩核冠修复方式相比,覆盖全面的高嵌体修复方式更微创。对于缺损面积有限的根管治疗牙的修复,采用全冠修复会磨除60%左右的牙体组织,如果采用高嵌体修复方式,可大大减少磨牙量,保留牙体组织,通过髓腔洞型引导高嵌体就位并增加辅助固位,亦可达到良好的抗折和修复效果(图4)。

图4 CAD/CAM切削(二硅酸锂增强玻璃陶瓷)高嵌体修复根管治疗后的下颌第二磨牙

覆盖咬合面的高嵌体或者面部分冠在应力传导上优于只覆盖部分咬合面的嵌体,为防止根管治疗牙折裂,优选将面全覆盖的贴面或者面部分冠;对于多次充填失败,存在较大面或邻面缺损的活髓牙的修复,高嵌体亦可以达到较好的修复效果(图5)。

图5 咬合面大面积缺损形成窝洞的上颌第一磨牙(活髓牙)用高嵌体进行修复

另外,牙齿面中重度磨耗的活髓牙病例也适用于高嵌体或者贴面修复。这类患者往往存在牙齿敏感、咀嚼效率下降等情况,修复后可缓解患者的临床症状,恢复牙齿的功能(图6)。

图6 中重度磨耗的下颌第二磨牙用CAD/CAM切削玻璃陶瓷贴面粘接覆盖改善症状

在进行这种修复时,最重要的是尽可能的保留和利用牙釉质进行粘接。基牙预备时不过多去除牙体组织,只是降低高陡的牙尖,预备围绕咬合面的互相平行的垂直向短轴面和1 mm宽的直角肩台,或者在原有缺损洞型外不额外预备肩台,只做微创基牙预备,仔细去除洞型周边的悬釉组织,避免侧向咬合力作用时存在过薄牙体组织而发生折断,降低牙尖高度保证咬合面留有充分的修复体间隙。

粘接力到底有多大?

是否能满足临床的需求?

粘接修复成功与否和有多少粘接面积尤其是牙釉质面积密切相关。通常,牙釉质的粘接强度要大于牙本质, 实验室检测粘接强度可用微剪切和微拉伸粘接强度、抗折强度等方法。牙釉质在全酸蚀后的平均树脂粘接强度(剪切力)为30 MPa,牙本质则为20 MPa,而不同牙位的牙釉质粘接面积举例如表1。

表1 不同牙位的牙釉质粘接面积

粘接力的表示常以压强MPa 为单位,1MPa≈10 Kg/cm2,成年人的咬合力约为22.4~68.3kg,所以只要有1 cm2以上的牙釉质粘接面积,剪切粘接力就大于咬合力。当然,咬合力负载方向主要以垂直向和侧向力为主,和实验室里的检测方向是有区别的,不能简单的推测是否能抵抗咬合力的大小,而且在临床上牙体预备量不同,剩余牙釉质的量也不同。以上颌中切牙唇侧为例(图7),牙釉质厚度在牙颈部只有0.3~0.4 mm,在中部只有0.5~0.7 mm,在切缘只有0.7~0.9 mm,在牙体预备过程中,一旦磨除牙釉质过多,就可能造成牙本质暴露,增加贴面脱落和折裂的风险。材料过薄容易发生折裂,使实际粘接强度发生变化,在牙体预备时一定要注意保留充分量的牙釉质和剩余牙体组织。根管治疗后下颌第二磨牙的牙釉质厚度约0.1 cm(图8)。

图7 中切牙唇面平均尺寸

图8 根管治疗后下颌第二磨牙的牙釉质厚度(约0.1 cm)

不同类型粘接修复的失败和提示

全瓷贴面的失败

全瓷贴面的失败表现主要是贴面脱落(图9)和折裂。

图9 瓷贴面脱落,考虑基牙预备过深,牙釉质剩余过少

根据临床研究,全瓷贴面的10 年平均存活率是86%,而粘接面全部是牙釉质时成功率高达99%,仅边缘为牙釉质时成功率是94%,贴面边缘在牙本质上时失败率是牙釉质时的10 倍。牙冠延长后行瓷贴面修复的失败率增加2.3倍。另有研究显示,失败率和瓷贴面的厚度及牙釉质的厚度成反比。

要保证粘接修复长期稳定要注意以下几点:充分的粘接面积,比如牙釉质粘接面积在70%以上;基牙预备在牙釉质厚度之内;选择合适的树脂粘接系统,能达到光固化初期固定后加强光固化使树脂充分聚合;表面污染影响粘接强度,止血剂降低牙本质粘接强度,所以粘接时要良好隔湿并避免污染;修复材料具有一定的强度和厚度以避免折裂。要控制咬合力对修复体的影响,比如避免咬在瓷贴面的粘接界面,去除咬合干扰,在下颌前伸运动到对刃位时,上下前牙同时接触,天然牙重接触,修复体轻接触,后牙脱离接触;在下颌侧方运动时,工作侧尖牙和/或一对以上的后牙颊尖同时接触,非工作侧后牙脱离接触,使力分散,免于创伤。

粘接义齿的失败

粘接固定义齿的失败表现为脱粘接(15%)和折裂(4.1%),而折裂最常发生在翼板和桥体的连结体处(图10~11)。研究显示,粘接固定义齿的5年平均存活率为91.4% [95% 可信区间(CI) 为86.7~94.4%],10年平均存活率为82.9% (95% CI为73.2~89.3%)。其中,氧化锆支架的存活率高,单端桥体的存活率高,前牙的存活率高。

图10 玻璃纤维增强树脂粘接桥的连接体断裂

图11 玻璃纤维增强树脂粘接桥脱落

为了减少脱粘接的比例,应该注意在不影响牙周健康和咬合的情况下尽量加大翼板的粘接面积,使用弹性大的树脂粘接系统,粘接过程需要有严格隔湿措施(如使用橡皮障);对于连接体容易折断的现象,应该特别注意以下几点:尽量做到连接体高度大于4 mm,厚度大于1 mm,连接体横断面积大于16 mm2,必要时增加厚度和材料强度。为了避免对牙周健康的不良影响,翼板的下缘(舌侧边缘)要位于龈上1 mm,翼板和连接体下方不压迫龈乳头,粘固后彻底去除多余树脂水门汀,维持牙齿生理形态,定期进行彻底牙周洁治,对患者进行口腔卫生指导。

高嵌体的粘接失败

高嵌体的失败主要表现为修复体折裂和脱落(图12),折裂主要发生在修复体过薄或厚度不均时薄厚交界的应力集中处。有研究显示,高嵌体的10年生存率大于90%,例如210个后牙热压铸瓷(IPS Empress)高嵌体3 年失败率在3.33%。研究也发现第二磨牙的高嵌体失败率高,死髓牙的高嵌体失败率高,材料厚度小于2mm时高嵌体失败率高。高嵌体边缘在牙本质上时失败率远高于在牙釉质上。全酸蚀(酸蚀-冲洗)的3步粘接法成功率较高。

图12 重度磨耗牙用贴面修复后上颌第二磨牙贴面折裂

临床制作高嵌体的常用材料有瓷化树脂、玻璃纤维(E 玻璃纤维或石英纤维)增强瓷化树脂、热压铸造二硅酸锂增强玻璃陶瓷、以及CAD/CAM切削+烧结二硅酸锂增强玻璃陶瓷等。当修复体较薄(小于1.5mm)时,玻璃纤维增强瓷化树脂的抗折强度较大,而修复体有一定厚度(大于1.5mm)时,CAD/CAM 切削+烧结二硅酸锂增强玻璃陶瓷的抗折强度较大。

高嵌体的粘接修复也需要保证充分的粘接面积,当同时依赖牙釉质和牙本质混合粘接时应注意有足够的牙釉质面积(50%以上),如果牙釉质不完整或缺损超过一壁,则应该改设计为全冠修复体。选择双重固化的树脂粘接系统。另外,修复体应该有充分的强度和厚度,避免厚度不均产生应力集中线;粘接时隔湿处理避免污染;咬合接触调整为邻牙紧密接触时的高嵌体轻接触。

如果修复体脱落后需要再粘接,则牙釉质表面粘接时强度无变化,但牙本质表面再粘接时强度下降。

玻璃纤维桩树脂核的粘接

玻璃纤维桩树脂核失败的主要表现是桩/桩核脱落或者玻璃纤维桩折断后桩核冠脱落(图13)。用成品纤维桩+树脂核的临床研究显示11%(4/36牙)的前牙桩核折裂,2.6%(2/73牙)的后牙桩核折裂。平均整体存活时间是90 个月。原因有脱落患牙的牙本质肩领不足、固位形差和桩核粘接后边缘发生微渗漏,造成粘接失败。2 mm 以上的牙本质肩领是保证桩核冠能长期存留的重要因素(图14)。

图13 玻璃纤维桩树脂核脱落后的基牙状态,缺乏充分牙体组织,唇侧和邻面的牙本质肩领高度小于0.5 mm。桩核表面有污染着色,有粘接界面的微渗漏和粘接失败

图14 牙本质肩领对牙冠脱位的抵抗作用

(本文部分内容参考自姜婷教授主编,人民卫生出版社2019 年出版的《实用口腔粘接技术图谱》一书)

作者简介

姜婷,北京大学口腔医学院修复科教授,主任医师,博士生导师,从事口腔修复学和学相关的医教研工作及临床咬合、口腔粘接修复、骨组织工程再生等方面科学研究;承担多项国家自然科学基金项目和省部级科研项目。是中华口腔医学会口腔修复学专委会委员,是国际牙科研究会、国际修复学院等国际学术团体会员。在国内外核心杂志发表专业论著70余篇,获得北京市科技二等奖(第二人)一次、三等奖(第三人)两次。主编和参编专业书籍及翻译专业书籍17部,包括《全口咬合重建》、《实用口腔粘接修复技术图谱》等。2015年获得北京大学医学部优秀教师称号。

来自《中国医学论坛报·今日口腔》

第294期03~05版

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本期编辑:CMT零一

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超嵌体、合贴面、髓高嵌体、髓超嵌体——后牙椅旁CAD/CAM修复的洞型分类

超嵌体、合贴面、髓高嵌体、髓超嵌体——后牙椅旁CAD/CAM修复的洞型分类

2017-03-07 18:51 根管治疗

目前,针对后牙椅旁CAD/CAM全瓷嵌体修复的洞型分类及命名尚不统一,第四军医大学口腔医院牙体牙髓科尝试将后牙缺损椅旁CAD/CAM修复洞型分为8种,以便于描述和交流。

昨天在微信中我们介绍了椅旁CAD/CAM修复洞型中的嵌体、高嵌体、全冠及嵌体冠 ,今天我们将继续介绍超嵌体、牙合贴面、髓高嵌体、髓超嵌体。

作者:田宇

第四军医大学口腔医院

超嵌体(Overlay)★

当修复体将牙齿咬合面全部覆盖时,将其称为超嵌体(Overlay)。超嵌体是一种特殊形式的高嵌体,通常在剩余牙体组织较薄弱时,采用这种修复方式保护剩余牙尖及侧壁,防止折裂(图10)。对于活髓牙,利用树脂粘接技术固位的瓷嵌体和高嵌体(部分覆盖咬合面),不仅能够保留更多的牙体组织,而且已经取得了令人信服的临床效果,因此,活髓牙已经较少采用超嵌体修复。而对于死髓牙的超嵌体修复,我们将其归类为髓超嵌体,具体见后。

图10 磨牙超嵌体的牙体预备。A.超嵌体预备后牙合面观;B.超嵌体预备后邻面观;C.超嵌体预备后颊面观

牙合贴面(Occlusal Veneer)★

1983年瓷贴面技术成功应用于临床,用来遮盖变色、四环素牙或氟斑牙,提高牙齿的美学效果,该技术主要应用于前牙的修复。采用全瓷粘接技术的嵌体和高嵌体修复的长期可靠性也获得了临床证实,这些促进了其修复适应证的进一步扩大,包括治疗较广泛的牙齿磨耗和隐裂牙齿。充分利用瓷贴面的粘接原则来弥补固位形态的降低,就发展出了一种没有固位形设计的薄的onlay/overlay形式的后牙修复体——牙合贴面(Occlusal Veneer),简单理解就是后牙咬合面的贴面(图11~12)。

图11 磨牙牙合贴面的牙体预备。A.牙合贴面预备后牙合面观;B.牙合贴面前邻面观;C.牙合贴面预备后邻面观;D.牙合贴面预备后颊面观

瓷材料的高弹性模量要求其必须具有一定厚度以承受咬合压力,通常牙合贴面瓷修复体的厚度推荐在1.5~2 mm,新的抗疲劳强度更高的材料的应用可以保留更多的健康牙体组织,目前可供选择的材料包括玻璃陶瓷、加强玻璃陶瓷、树脂改良玻璃陶瓷以及可切削树脂等。马涅(Magne)等利用体外实验研究了陶瓷和树脂材料制作的牙合贴面的抗疲劳性能,发现树脂材料制作的牙合贴面具有更高的抗疲劳性能。

图12 26牙合贴面修复。A.26修复前牙合面形态;B.对颌牙36牙尖强壮,稍伸长;C.26牙体预备后牙合面观;D.36调磨牙尖,降低咬合,注意避免牙本质暴露;E.26弹性瓷牙合贴面修复后牙合面观;F.26弹性瓷牙合贴面修复后颊面观

虽然后牙牙合贴面修复的材料选择和远期临床可靠性仍需要有更多的临床数据来验证,但这种更加保存的修复方式无疑为后牙牙合面缺损的修复提供了新的选择。

髓高嵌体(Endo-onaly)

髓高嵌体(Endo-onlay)是一种针对根管治疗后的牙齿制备的利用髓腔固位形态的高嵌体洞型。其增加了瓷修复体的髓腔机械固位形态,同时保护相对薄弱的牙尖结构。根管治疗后的后牙通常建议做全冠修复来保护牙齿。但有时牙体组织的缺损很广泛,仅剩余较薄的牙体组织侧壁,全冠预备将导致剩余牙体组织的进一步减少;或者有时仅因为邻面较局限龋坏引起的牙髓炎症而进行的根管治疗,剩余牙体组织侧壁仍具有较强的抗力。这种情况能否采用更加保存的高嵌体来修复呢?

亚马内尔(Yamanel)等用三维有限元法研究了树脂或瓷嵌体、高嵌体修复对牙齿应力分布的影响,结果发现全瓷嵌体、高嵌体能够传导到牙体组织的应力更小,推测瓷嵌体、高嵌体修复对死髓牙会有同样好的效果。厄兹杨尼(Ozyoney)等临床评价了玻璃陶瓷高嵌体修复根管治疗后严重缺损牙齿的效果,经4年的随访评价,成功率为92.5%。霍姆西(Homsy)等临床比较了瓷嵌体/高嵌体修复活髓或死髓后牙,经过2年的临床观察,采用瓷嵌体/高嵌体修复的后牙,死髓牙组和活髓牙组之间没有差别。

虽然这些研究初步证实了髓高嵌体修复的临床有效性,但这种修复体形态设计仍需要有更多及更长时间的临床研究来验证。

磨牙髓高嵌体牙体预备如图 13。

图13 磨牙髓高嵌体的牙体预备。A.髓高嵌体预备后牙合面观;B.髓高嵌体预备后邻面观;C.髓高嵌体预备后颊面观

髓超嵌体(Endo-overlay)

髓超嵌体(Endo-overlay, Endocrown)就是指增加了髓腔固位形态的超嵌体洞型。对于根管治疗后的后牙,覆盖整个咬合面的修复形式仍然是被多数口腔医师所推荐的。Pissis等于1995年报道了髓腔固位陶瓷部分冠来修复根管治疗后的磨牙。宾多(Bindl)和默尔曼(Mörmann)在1999年将这种修复体形式命名为“endocrown”,是指这种既有宏观机械固位,又有微观粘接固位的,锚定在后牙牙髓腔内的陶瓷一体冠。髓超嵌体的边缘位于牙颈部之上,远离颈部的设计保留了更多的牙釉质,提高了粘接的效果。

图14 磨牙髓超嵌体的牙体预备。A.髓超嵌体预备后牙合面观;B.髓超嵌体预备前邻面观;C.髓超嵌体预备后邻面观;D.髓超嵌体预备后颊面观

Homsy等的临床研究虽然证实瓷嵌体/高嵌体修复的后牙,死髓牙组和活髓牙组之间没有差别,但在其选择的病例中,修复体的宽度约为颊舌侧牙尖间距离的1/2。对于更广泛的牙体组织缺损,仍然建议采用覆盖整个咬合面的超嵌体形式的修复体设计。根据迪肯(Dijken)等的研究,覆盖牙尖的玻璃陶瓷超嵌体的理想厚度要达到2 mm。林(Lin)等的研究建议缺损累及两侧邻接面的根管治疗后的后牙,典型的MOD缺损,应采用髓超嵌体的方式修复,以对抗咬合压力并防止牙尖的侧方折裂。

与全冠相比,髓超嵌体可以使修复体边缘远离牙周膜,且保留了周围的牙釉质,釉质粘接的优良性能有利于获得修复体的边缘稳定性,更好地防止微渗漏。目前的一些临床研究表明,髓超嵌体的成功率介于94%~100%,其临床表现类似甚至优于传统的桩核冠修复,提示全瓷髓超嵌体修复方式适用于较大牙体缺损的根管治疗后的后牙。能够保留更多健康牙体组织的髓超嵌体修复方式尚未广泛开展,应当进一步推广应用。

磨牙髓超嵌体的牙体预备如图14(上图),临床示例如图15(下图)。

图15 46牙髓超嵌体修复。A.46术前牙合面形态;B.46根管治疗并髓超嵌体预备后牙合面观;C.电脑设计修复体;D.修复体颊舌向剖面形态;E.46修复完成后;F.46修复完成后不同角度

小结

为了便于描述和交流,我们依据牙体缺损的部位和牙体预备后的窝洞形态,将后牙缺损椅旁CAD/CAM修复洞型分为以上8种,各种洞型之间既相对独立,又有一定的内在联系。例如,超嵌体是一种特殊类型的高嵌体,咬合面全部覆盖的高嵌体就是超嵌体;牙合贴面可以看做是一种特殊类型的超嵌体,其是没有盒型洞固位形式的超嵌体,或者说是一种特殊的部分冠,由于玻璃陶瓷修复体树脂粘接固位的特性,当将部分冠边缘向牙齿牙合向设置时,就成了牙合贴面。

此分类法基本覆盖了各种后牙缺损及其修复洞型,虽然有些修复类型的临床适应证及长期效果仍有待更多的临床研究来佐证,但统一规范的分类命名无疑会为后牙缺损椅旁CAD/CAM修复设计提供指导,有利于后牙全瓷修复技术的推广应用和医师之间的学术交流。

作者简介

田宇,医学博士,副教授、副主任医师,硕士研究生导师。第四军医大学口腔医院牙体牙髓病科副主任。担任中华口腔医学会牙体牙髓病学专业委员会委员,陕西省口腔医学会牙体牙髓病学专业委员会副主任委员,全国卫生产业企业管理协会数字化口腔产业分会常委。主要从事牙体牙髓病的临床、教学和科研工作。临床专长为疑难根管的显微治疗,牙体缺损的椅旁CAD/CAM修复技术。

来自《中国医学论坛报·今日口腔》

第148期第07~08版

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请珍惜那些给你做“盖髓术”的牙医!

请珍惜那些给你做“盖髓术”的牙医!

KQ88口腔医学网

以下文章来源于魔术牙医,作者魔术牙医徐勇刚

魔术牙医

关注口腔健康深度科普,关注创意医学文化,构建和谐医患关系。 我是中国人民的医生,我深情地爱着我的祖国和病人!

在国内牙医圈里,愿意做“盖髓术”的牙医越来越少,对一些龋源、牙髓源性病例(临界病例)多半都是直接上“根管治疗”,这种现象值得反思,但它绝不是医生单一因素造成的,更多是由医患关系、经济代价等等复杂的现实纠结下形成的。今天我对此作一次深度科普,希望能帮到那些对牙齿健康极致呵护而又足够理性的患友们。

        要想深度理解“盖髓术”的适应症,首先要了解牙齿的解剖结构和龋齿进展。

       简单地说,牙齿由两层硬组织(牙釉质、牙本质)和一层软组织(牙髓)所构成,容纳牙髓的中空腔隙管道叫做根管,龋齿的进展都是从釉质到牙本质到牙髓逐层深入腐坏,依病情不同主要有两种不同的治疗手段:1、早期釉质龋坏为浅洞,没有疼痛,只需及时补牙充填龋洞即可;2、晚期若牙髓病变,导致强烈的自发痛、夜间痛、放射至头面部剧痛,或者慢慢发展成咬合痛,则需根管治疗,即去除牙髓(杀髓)、清理消毒根管并将根管严密充填。

       临床还有大量的深龋病例,无论从龋损程度还是疼痛表现,都处在上述两种情形的中间状态,即,龋洞已达牙本质深层接近牙髓,伴随冷热刺激痛,有时疼痛剧烈,形成“可复性牙髓炎”。在临床上,这种病例真不少,而由于种种原因,很多都按常规牙髓炎的治疗方案直接进行根管治疗了。

       这些病例本来可以先尝试“盖髓术”,它是一种保护活髓的方法,即用一类具有使牙髓病变恢复效应的制剂覆盖在近髓的牙本质上或已穿露的牙髓创面上,以保护牙髓,使其病变消除。临床分为直接盖髓术和间接盖髓术,使用的材料统称为盖髓剂,前者盖在已经暴露的牙髓组织上,后者盖在接近牙髓的牙本质上,目的都是保护活髓,促进病变恢复。

       在我的印象里,二十多年前牙医做盖髓术很常见,而现在越来越少,那么,原因在哪里呢?客观来说,由三种因素合力造成的。

       1,费用。二十年前盖髓剂基本上以氢氧化钙为主,很便宜。现在盖髓剂多选用生物材料比如MTA, IROOT-BP,等等,昂贵,属于牙科材料中单位体积价格最高的,胜过黄金,但是它们比氢氧化钙具有更高的保髓成功率。因为昂贵,很多牙科诊所都不进这种材料,当然更多是理念与知识沉淀的差异,盖髓做得越多,越有经验与底气。

       2,成功率。尽管现在的生物材料盖髓成功率不低,但是仍然有一定的失败几率,毕竟,病变牙髓组织能否在盖髓剂的作用下完美恢复并且长期稳定,无法完全预见与预期。龋齿进展到哪一期,很多时候并不是像教科书里那么明显,需要视诊、探诊结合X线牙片分析,医生对牙髓状态的评估、对盖髓材料的掌控,都跟经验积累呈正相关。

       3,医患关系。20年前盖髓术常见,失败也常见,大不了再进行根管治疗,没多少患者纠结失败。而现在,如果给患者行盖髓治疗后出现疼痛、自发痛,宣告治疗失败而最终施行根管治疗,患者可能会由此质疑医生:“早知这样,为啥当初不直接进行根管治疗,为啥要做盖髓术而且这么贵?”,其实他们根本就无法理解,这样的牙医反而是更为患者着想的牙医!

       当一名患者因为深龋近髓产生刺激痛,或者是医生在清除龋坏牙组织时意外穿髓疼痛,对于牙医自身而言,最安全的做法不是保髓护髓,而是杀髓后行根管治疗,这样可以很快解除患者疼痛,医疗纠纷少。但对于患牙尤其是年轻恒牙而言,最优的方案其实是盖髓术,一旦完美成功保髓后,患牙可能远离根管治疗,即可能远离烤瓷冠修复,即可能远离后续种种不爽,然而必须接受不可预期的盖髓失败的可能性。

       这是一种非常矛盾的现状。由于口腔医学科普的缺位,患者对牙病的复杂性毫无认知,“花了钱治疗就必须有效果”的思维是常态(盖髓术失败而要求退费的人客观存在),这造成了牙医在选择盖髓术时,除了考虑患牙状况与适应症,还要考虑患者是否为纠结型人群。

       因为患者的纠结而放弃“盖髓术”,选择根管治疗术,这是中国牙医的悲哀,却是一种冰冷的现实。有时候拿着钻机准备钻牙杀髓的那一刻,会感觉自己太残忍,但想想患者各种油盐不进,拒不接受盖髓术可能的失败与价格,也是哀莫大于心死。

       我有时候实在过不了自己心理这一关。有一次,一个9岁女孩因六龄齿深龋近髓、冷热刺激痛,予以去龋时意外穿髓,跟家长(其父)沟通建议先行盖髓治疗,如果疼痛加重再考虑根管治疗,各种利弊及价格沟通以后,家长仍选择直接根管治疗。我当时心里急呀,对这样的年轻恒牙,用IROOT-BP盖髓,我的把握其实是很大的,但话又不能说满。他最大的顾虑可能是钱,为了让他接受盖髓术,我情急之下作出这种承诺,先作盖髓术,其实价格和根管治疗差不多的,万一失败以后再做根管治疗我给你免费!他还在犹豫,可能在纠结我的动机,当时真想把心敞开给他看!

       那次艰难的医患沟通后,最终达成了盖髓治疗决定,幸运的是,治疗效果良好,接着把牙也补好了,观察两年多比较稳定,大概率可以远离根管治疗了。也许,在他看来,就是花费了一笔不小的费用给孩子补了一颗牙,他根本无法想象如果直接给年轻恒牙做根管治疗意味着什么,————先要做根尖诱导成形,再根管充填甚至行根尖屏障术,后期的随访、冠修复,甚至并发症导致拔牙、种植牙,等等各种潜在的可能性!

       而遇到类似这样的病例,我不可能每次都用这种承诺式沟通,毕竟我也经历过失败病例带来的纠结,所以多数时候仍然是正常沟通+知情告知+签字,临床实践表明,只有那些具备足够知识储备,对医生满怀信任,对牙齿健康充分呵护而经济宽裕的人,才最终得以获取“盖髓术”带来的牙齿健康巨大收益。

       这么说吧,如果我自己的牙齿深龋近髓伴随刺激痛,我会毫不犹豫选择“盖髓术”,哪怕最终花费上千元仍然可能失败,我也一定要尝试。只有牙医才能理解,放弃保活髓而直接根管治疗,让活髓牙成为死髄牙,那是用于无法缓解的牙髓炎疼痛,属于没有办法的办法,但凡有一丝保活髓的机会,都要尽量尝试。

       当然,大家也不要因此而过度拔高“盖髓术”,进而去质疑临床上根管治疗方案太草率云云。毕竟,成功的“盖髓术”,更依赖于医生对适应症的把控,正确的诊断,对盖髓剂的熟练应用,这是一个大前提,然后才是患者的理解,还有良好的医患关系。

       洞悉了这样一种牙科生态系统后,当你的牙医愿意给你做“盖髓术”时,不论结果如何,你应该感到欣慰并且珍惜这样的牙医,同时,你也要为自己感动,因为你在牙医眼里是理性而容易沟通的一类人,如果过于患得患失,“盖髓术”大概率会与你失之交臂。

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IDS 即刻牙本质封闭-韩慧敏的博客-KQ88口腔博客

IDS 即刻牙本质封闭-韩慧敏的博客-KQ88口腔博客

               牙体预备后取模前使用DBA封闭牙本质小管,消除牙体敏感,减轻细菌微渗漏,增加牙本质粘结固位 

牙本质根管口的处理:

1.根充剂的选择(死髓牙):不含丁香油 

2.冲洗剂的选择:洗必泰最佳 

3.髓腔处理材料的选择:玻璃离子、树脂

步骤

 •活髓牙 •

1.牙本质浅层:37%磷酸15s+粘结剂+树脂 

2.牙本质深层:a 37%磷酸10S+粘结剂+树脂                                                                                                                            b 自酸+粘结剂+树脂                                                                                           

                         c 自酸+37%磷酸10S+粘结剂+树脂

死髓牙 

•1.髓腔:37%磷酸60S+粘结剂+流体树脂+树脂 

2.根管口:a 37%磷酸60S+粘结剂+流体树脂+树脂                                          

                  b 37%磷酸60S+粘结剂+玻璃离子+流体树脂+树脂

基牙build-up髓腔内部重建

1、封闭牙本质小管,减少微渗漏防止术后敏感 

2、防止牙本质胶原纤维塌陷   增强粘结强度 

3、消除倒凹,洞型光滑  预备更微创 

4、粘结操作更简单 瓷层更均匀 

5、更准确就位  就位制动

BLOCK-OUT  IDS  操作步骤

1.暴露新鲜牙本质 

2.35%-37%磷酸处理牙本质,活髓牙10-15S,死髓牙40-60S 

3、流动水冲洗,吹干 

4、涂布底漆+粘结剂 

5、流体树脂封闭根管口(厚度小于1mm) 

6、树脂分层充填,光照 

7、涂布阻氧剂光照 

8、去除阻氧   

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