ImageJ实用技巧——自动细胞计数(解放双手篇)

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操作视频更新:

操作视频-ImageJ自动细胞计数

对于生物狗和密集恐惧症患者来说,手动数细胞是一个极其无聊以及耗费精力的工作。

还记得被红血球计数板支配的恐惧

这个红血球是不是好数多了

扯远啦~上一篇为大家介绍了ImageJ的安装,以后的文章我会以实际应用的方式,解释ImageJ各种目录以及功能。

这是解放双手篇的第一篇——利用ImageJ实现自动细胞计数。我也会介绍一下多种细胞手动计数的方法。

利用ImageJ进行自动细胞计数的工作流程(Workflow):

一、自动细胞计数

1、打开想要处理的图像(File-Open,或者将图片直接拖动到菜单栏)

以一张DAPI免疫荧光染色照片为例

我们的目标是:自动对DAPI染色的细胞核进行计数,得到细胞核的总数。

2、将图像转为8-bit(Image-Type-8-bit)

RGB格式简介:一般彩色的荧光图片都是RGB格式的。RGB代表红、绿、蓝三种颜色,可以通过这三种颜色的叠加得到各式各样的颜色。

而RGB的每个通道各有256级亮度,用数字表示为从0、1、2…直到255。在0时最弱,而在255最亮。

例如,纯红色的R值为255,G值为0,B值为0,即(255,0,0)。灰色的R、G、B三个值是相等的(除了0和255);黑色的R、G、B都为0,;白色的R、G、B都为255。

按照计算,256级的RGB色彩总共能组合出约1678万种色彩,即256×256×256=16777216。也称为24位色(2的24次方)。

RGB彩色立方体

当我们把一个RGB图像,转换为8-bit图像时,其实就是来了一个简单的缩放。使用以下公式转换为灰度:

[灰色=(红色+绿色+蓝色)/ 3] 或 [灰色= 0.299×红色+ 0.587 ×绿色+ 0.114×蓝色]

转换为8-bit之后,每个像素仅仅只有一个通道,有256级灰度,即0~255,表示亮度从深到浅,对应图像中的颜色为从黑到白。

转换为8-bit图像

3、调整阈值,去除背景,选中细胞核(Image-Adjust-Threshold)

Threshold后,选中的细胞核为红色

注意选择Red来进行表征,所以变为红色的区域就是已经选中的区域。

注意背景是黑的,所以要勾选Dark Background!

这时候可能需要进行两项操作:

(1)如果图像带有比例尺:拖动调节阈值的上限可以去除比例尺(因为自动计数可能会把比例尺也当做细胞来统计)

(2)如果自动阈值效果不好:换拖动调节阈值的下限,可以增加选中区域,但要注意在选中细胞核的同时,尽可能少的减少背景。或者选择不同的自动阈值算法。

拖动完成后点击Apply,图片转为非黑即白的二值化图片:

5、填补细胞核的空隙(Process-Binary-Fill Holes)

在调节阈值减少背景的同时,可能细胞核的一些不均匀部分也被减弱了,可以填补空隙,使得细胞核变成实心球形。

6、打断细胞核的重叠部分(Process-Binary-Watershed)

可以将重叠的细胞核分离开

细胞密度比较大时,通常会有细胞重叠或者贴近的情况。可以利用Watershed自动识别重叠部分,并将两个细胞核分离开来。

7、自动分析、计数颗粒(Analyze-Analyze Particles)

自动颗粒分析的界面

出现Analyze Particles界面,通过不同的情况设置参数,最重要的是红框中的参数

Size:0.05-Infinity——指分析颗粒尺寸大于0.05(一定注意这里的单位是inch),一直到无穷大的颗粒。(根据细胞大小,以及结果好坏来更改

Circularity:0.00-1.00——指圆度,可以根据细胞形状,调整需要的圆度,1.00为标准圆。

Show:Overlay——指原本图片上会展示出分析结果的外框。

Exclude on edges——处于边缘的颗粒不计入

设置完成后,点击OK,即出现以下结果:

计数结果

可以看到最后统计出的细胞核数为147,且每个细胞核的面积也在Results中显示出来。可以放大检查原图中是否有多数或者漏数的细胞。

注意:自动计数并不是完全准确的,如果发现自动计数与实践明显出现偏差,出现多数或者漏数,需要优化阈值(Threshold)和颗粒尺寸的判断标准(Size以及Circularity)。并且形状无规则的细胞,例如神经细胞,不适于自动计数,需要手动计数,所以接下来介绍一下利用ImageJ进行手动细胞计数。

二、手动细胞计数

主要有两种方法:

1、Multi-point工具

右键可以选多点工具或单点工具

双击可以更改点的形态、颜色和大小。使用的时候直接点击细胞,就会自动的标号。但对于多种细胞类型分别计数,并不是很便捷。

更改点的各种参数

2、Cell Counter插件

这就显示出Fiji,相对于传统的ImageJ的优势了。基本能用上的插件,都已经包含在程序中,只需要搜索即可。例如我们在搜索框中输入:Cell,即可出现Cell Counter这个插件的选项。选中后,点击Run即可。

搜索Cell Counter插件

然后就会出现Cell Counter插件的界面,可以对多种细胞进行计数,并且在同一图像中显示出来。具体的应用其实非常简单,在这里就不再赘述了。

Cell Counter插件的界面

细胞自动计数和手动计数,大概介绍完了。如果想熟练掌握,可以随便百度一张红血球计数板的照片,按照上面的步骤一步一步操作即可。

Measure

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