在293 细胞中大量扩增腺病毒

一旦重组病毒已被纯化和鉴定,即可在293 细胞中进行大量扩增。本手册提供了递增培养规模和腺病毒感染周期的基本方法,按这一方法最终得到的病毒量约为3×1011~3×1012。由于一个细胞中所含的病毒颗粒为1000~10000,因此1L 培养细胞可得到约5×1012 病毒颗粒。如果要把病毒用氯化铯梯度离心纯化,则必须至少3×108 的细胞,这样才能正确分辨出病毒带。

对于蛋白表达,则根据需要可在任何一步扩增步骤中停止,离心沉淀细胞后按照适当的操作方法进行蛋白抽提(根据蛋白类型的不同抽提上清或细胞沉淀)。为优化时间进程,每个感染周期必须与下一次细胞扩增培养同步。如果由于各种原因不能同步,则必须将病毒冻存,直至下一次细胞培养开始后再融化病毒。注意每次扩增都将会剩下一些病毒,这些病毒先不必丢弃,以便下一步扩增失败时备用。每次扩增最好都用最低代的病毒颗粒,这样产生突变型病毒的可能性会大大降低。

操作步骤:

1 在100mm 培养皿或75cm2 培养瓶中加入10ml DMEM5%培养5×106 293 细胞。

2 取0.5ul 首次扩增的病毒保存液,加入DMEM5%至1ml,混匀,这样稀释得到的MOI 值约为5。

3 移去培养液,小心加入病毒混合液,切勿破坏细胞单层,十字形慢慢晃动3 次,37℃ CO2 孵箱中培养90 分钟。

4 加入9ml DMEM5%。

5 再培养72 小时,这时在10ml 溶液中大约有5×109~5×1010 个病毒颗粒,进行MOI 测定以估计病毒颗粒。

注:如果此时得到的病毒量已足够,可立即进行病毒滴度测定。收集细胞,600×g 离心5 分钟沉淀细胞,去上清后加入最小体积(一般为原始体积的1/10 即1ml)病毒保存溶液重悬细胞。-200C /370C 冻融3 次,台式离心机上以最大速率离心去除细胞碎片,收集上清,然后进行病毒滴定。

6 -20℃/37℃冻融3 次。

7 转入15ml 无菌离心管中,台式离心机上以最大速率离心10 分钟,收集上清冻存于-20 ℃或-80 ℃。

8 3 个175cm2 培养瓶中各加入107 293 细胞进行培养。

9 将3ml 细胞裂解液上清加入12ml DMEM5%中,混匀。移去细胞培养液,每瓶小心加入5ml 混合液,十字形慢慢晃动混匀3 次,370C 5%CO2 孵箱中培养90 分钟。此时MOI 值约为25。

10 加入DMEM5%至30ml。

11 再培养48~72 小时。此时10ml 培养液病毒量约为3×1010~3×1011。若需要,进行MOI 测定以估计病毒滴度。

注:如果此时病毒量已可以满足实验所需,则可立即进入病毒滴定步骤。600×g 离心5 分钟收集细胞,弃上清,加入1/10 原始体积的溶液重悬细胞。-200C /370C 冻融3 次,台式离心机上以最大速率沉淀细胞碎片,收集上清,进行病毒滴定。

12. 移入50ml 离心管中,台式离心机上最大速率离心10 分钟,取出上清保存。

13. 30 瓶175 cm2 培养瓶中每瓶各加入107 293 细胞。

14. 将45ml 细胞裂解液上清加入105ml DMEM5%混匀,从培养瓶中移去培养液,加入5ml 混合液感染细胞,十字形缓慢晃动3 次混匀,370C 培养90 分钟。此时MOI 值约为25。

15. 加入DMEM5%至30ml/瓶。

16. 再培养48-72 小时,此时约有3×1011~3×1012个病毒。若需要,进行MOI 测定估计病毒滴度。

如果要收集病毒颗粒,先收集被感染细胞,然后重悬在5ml DMEM5%中。-200C /370C 冻融3 次,离心沉淀细胞碎片。此时5ml DMEM5%中3×1011~3×1012 个病毒颗粒,浓度为6×1010~6×1011vp/ml。然后测定病毒滴度,或者用标准的氯化铯密度梯度离心法纯化病毒。

在109 细胞中扩增病毒可获得大量病毒保存液,而在1010 细胞中扩增则有一定技术性。切勿将扩增后的病毒保存液再用来感染细胞,因这会大大增加RCA 产生量。有时不得不使用纯化空斑以最大可能降低RCA 产量。如果已没有纯化的空斑,那么就不得不重新空斑纯化重组病毒,鉴定克隆后再进行扩增。

如果需要大于扩增4 轮后的病毒量,注意请用早期的病毒作为扩增源。比如,用第2 代病毒产生第3 代病毒。如果没有第2 代病毒,那么必须用第1 代病毒来产生新的第2 代病毒。按这个原则进行扩增可使RCA 水平尽可能低。

如果用于表达蛋白,则可以收集细胞后根据蛋白特点选择适当方法抽提蛋白。细胞沉淀中一般可提取1-5mg 蛋白,建议在小规模扩增后先测定感染后抽提蛋白的最佳时间,然后再大量扩增蛋白。

腺病毒扩增

第一代 第二代 第三代 第四代
每瓶细胞数 1×105 5×106 1×107 1×107
培养瓶大小(cm2) 75 175 175
培养瓶数 24 孔板1 孔 1 3 30
首次扩增后的病
感染来源 稀释的空斑 第二代病毒 第三代病毒<>
毒保存液
0.5 mL 或
每瓶接种量 0.1 mL 1 mL 1 mL 1.5 mL
2.5×107
总培养体积 1 mL 10 mL 90 mL 900 mL
MOI 0.01 5 25 25
滴度(VP/mL) 1×108·9 5×108·9 3.3×108·9 3.3×108·9
总病毒量 1×108·9 5×109·10 3×1010·11 3×1011·12

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