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        大家好,今天为大家分享一篇发表在Cell上的文章,文章的通讯作者是来自日本RIKEN脑科学研究中心的Atsushi Miyawaki教授和日本武田制药的Yoshiyuki Tsujihata。Miyawaki教授的实验室专注于开发荧光实时成像相关的生物可视化技术。

      在本文中作者关注了线粒体自噬这一生命过程。线粒体自噬(Mitophagy)是选择性的清除受损或者多余的线粒体,最终通过溶酶体降解。在之前对于自噬的研究中,通常使用EGFP和mCherry的串联融合表达,利用两种荧光蛋白对溶酶体环境的敏感性不同,从而监测自噬过程。理论上也可以通过串联荧光蛋白标记去监控线粒体自噬,但问题是很难实现探针的线粒体完全定位,预先靶向或不完全靶向都会导致探针通过其他途径进入溶酶体,从而产生假阳性。作者在2011年开发了一种线粒体探针mt-mKeima,该荧光蛋白具有可逆的pH敏感性,适用于活体标本中的线粒体成像。在本文中作者希望在此基础上开发一种还能应用于固定样本的荧光蛋白探针,并将其应用于帕金森病的相关研究中。

      监测自噬的最直接方法就是开发完全耐酸的特殊荧光蛋白,作者筛选了一个来自珊瑚虫的蛋白文库,得到了一个发蓝光的荧光蛋白——afCFP(TOLLES),它在pH=4的条件下有最大荧光强度,且对溶酶体蛋白酶具有抗性。接着作者对串联荧光蛋白系统进行了改进,mCherry-EGFP系统的一个问题是FRET供体EGFP可以在溶酶体中被降解,因此作者设计了以TOLLES为供体、YPet为受体的FRET体系,命名为SRAI。作者在小鼠胚胎成纤维细胞中测试了SRAI的效果,结果显示饥饿处理后TOLLES信号出现了反映溶酶体的点状信号,且使用4%多聚甲醛PFA固定后信号被完全保留。

       接下来作者关注了线粒体自噬问题,之前作者曾尝试把mt-mKeima融合在COX VIII的前序列上,从而将其定位在线粒体基质,但mKeima对多聚甲醛敏感,因此无法对样本进行固定,不适合高通量分析;而SARI对固定不敏感,因此有望实现这一目标。作者首先表征了蛋白标签在线粒体中的定位特异性,并最终筛选出了mt-SRAI-CL1-PEST(简称mitoSRAI)的蛋白序列。为了实现高通量筛选的目的,作者以强力毒素依赖的方式构筑了mito-SRAI的轮转系,为之后的高通量筛选做准备。

       作者接着进行了线粒体自噬诱导剂的高通量筛选工作。线粒体自噬可以清楚受损的线粒体,后者与衰老和多种人类疾病有重要关系,因此对线粒体自噬诱导剂的需求很大,但目前为止还没有相关的新药被开发出来。作者在384孔板中构建了一个基于共聚焦成像的筛选平台,为了模拟受损的线粒体,作者使用了低剂量的FCCP来处理。76000多种化合物被用来进行筛选,通过评估化合物对受损线粒体的清除能力,最终筛选出了化合物T-271,并通过受损线粒体的小鼠模型证明了T-271的自噬增强效果。

       后续作者还尝试在帕金森病的小鼠中表达了mitoSRAI,进一步研究了线粒体自噬对细胞自我调节的积极作用。总的来说这篇文章中作者开发了用来检测线粒体自噬的荧光蛋白探针SRAI,并利用这一工具进行了线粒体自噬诱导剂的高通量筛选,筛选到了特异性靶向受损线粒体的化合物T-271。

 

本文作者:LYP

原文链接:https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S1074552111002043

原文引用:DOI:10.1016/j.cell.2020.04.025

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