人生第一次尝试Chip-seq analysis
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发布于 2023-05-17 22:59:27
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20230517 书
由于课题需要开始学习Chip-seq的分析方法，Chip-seq的原理已经有很多介绍啦，我就不再写了。
下载数据 — prefech 下载SRA文件
# Linux 中使用Prefetch 进行下载
for i in $(cat SRR.txt);do prefetch $i;done使用Fastq-dump 进行SRA 文件分割
# fastq-dump 进行文件分割 SRA -> fastq.gz
for i in $(cat SRR.txt);do fastq-dump --gzip --split-3 $i/$i.sra;done使用bowtie2 进行比对，比对前需要构建index
nohup bowtie2-build hg19.fa hg19 & > nohup01.out
bowtie2 -p 6 -3 5 --local -x /reference/bowtie2_index/hg19 -U sample1.fastq.gz | samtools sort -O bam -o ../aligned/sample1.bam &使用MACS3 进行样本间比较（后续可视化使用）
###重复一起输入找共有peaks
macs3 callpeak -t sample1.bam sample2.bam -c input1.bam input2.bam -f BAMPE -n sample --outdir ./ -g 2.7e9 -B
###重复分别进行比对
macs3 callpeak -t sample1.bam -c input1.bam -f BAMPE -n sample1 --outdir ./ -g 2.7e9 -B
macs3 callpeak -t sample2.bam -c input2.bam -f BAMPE -n sample2 --outdir ./ -g 2.7e9 -B
# -t treatment FILENAME,若多个重复，可以-t A B C
# -c control FILENAME,若多个重复，可以-c A B C
# -f 指定输入文件，我这是BAMPE格式，注意必须是sort后的bam.
# 可以是”ELAND”, “BED”, “ELANDMULTI”, “ELANDEXPORT”, “ELANDMULTIPET” (for pair-end tags),
# “SAM”, “BAM”, “BOWTIE”, “BAMPE” “BEDPE” 任意一个。如果不提供这项，就是自动检测选择。
# -n 生成的文件前缀名
# --outdir 结果文件存放位置，我这里是当前目录
# -g 参考基因组大小hs: 2.7e9; mm: 1.87e9; ce: 9e7; dm: 1.2e8, 不在其中的话，比如说拟南芥，就需要自己提供了。
# -B 会保存更多的信息在bedGraph文件中，如fragment pileup, control lambda, -log10pvalue and -log10qvalue scores
# -q: q值，也就是最小的PDR阈值， 默认是0.05。q值是根据p值利用BH计算，也就是多重试验矫正后的结果。
# -p： 这个是p值，指定p值后MACS2就不会用q值了。
# -m: 和MFOLD有关，而MFOLD和MACS预构建模型有关，默认是5：50，MACS会先寻找100多个peak区构建模型，一般不用改，因为你很大概率上不会懂。得到以下结果
MACS3 结果文件
Rscript model.r 得到Pdf 文件
后续可视化进行中……
Deeptools
# 需要首先构建BAM index
sam-tools index sample.bam
# 比较BAM文件
bamCompare -b1 SRR21743214_sort.bam -b2 SRR21743217_sort.bam -o sample_1.bw
# 单个BAM文件
bamCoverage -b x.bam -of bigwig -o x.bw -p 20 --ignoreDuplicates --binSize 10 --normalizeUsing RPKM
# 后续进行可视化参考信息
https://www.jianshu.com/p/96688fecd864 全面的chip-seq流程
https://www.jianshu.com/p/2b8e2ea26665 主要的参考流程https://www.jianshu.com/p/26aaba19a605 Chipseeker
https://www.jianshu.com/p/e2b871e93e54 Deeptools1
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