撰文丨许韧 博士

责编丨迦溆

组织特异性干细胞的鉴定和分化成熟，一直以来都是各器质类疾病研究和癌症发生中的经典问题，决定了药物开发和诊疗策略的方向。长久以来，骨骼研究学者们也一直聚焦于骨髓微环境的干细胞分化“事件”：间充质干细胞分化的成骨细胞和造血干细胞由来的破骨细胞所介导的骨代谢平衡。然而，相比较于研究透彻的造血干细胞系统，间充质干细胞特别是成骨干细胞的鉴定和分化研究，一直以来仍处于相对空白或滞后的状态，成为了深入骨骼和相关疾病研究的“瓶颈”。

近年来，随着单细胞测序技术和共聚焦显微成像的发展和运用，髓内间充质干细胞的鉴定和功能解析逐渐成为学科内新的研究热点。2015年， 斯坦福大学Michael T. Longaker研究团队首次在Cell杂志上发文【1】，系统性阐明了小鼠骨骼干细胞的富集策略和“干”性鉴定，解决了困扰学术界以久的成骨干细胞的定义问题。同期，哥伦比亚大学的Timothy C. Wang团队也于Cell报道了Gremlin1 标记的骨骼干细胞的分化潜能【2】。这两项背靠背的研究吹响了骨骼干细胞研究的号角。近期，Michael T. Longaker课题组更是开创性地鉴定了人类骨骼干细胞及其分化的等级关系【3】（Cell突破丨人类骨骼干细胞终于被鉴定出来），为骨骼疾病的精准治疗奠定了分子遗传和发育的理论基础，预示着一场硬组织干细胞的研究“风暴”即将来临。

图一 经典骨骼形态解剖学

经典骨骼形态解剖学显示骨骼系统被皮质骨天然隔离成骨腔内环境和骨膜外环境(如图一)。然而，长久以来，骨生物学家们一直专注于髓内多能干细胞的功能和临床运用，却忽略了骨膜潜在的干细胞属性。试验和临床上的大量数据表明，骨骼系统的发育和再生与其包被的骨膜有着千丝万缕的联系， 例如骨折的愈合和促骨形成药物的响应等。既然骨膜的功能在生理和病理条件下都如此重要，那么骨膜中的成骨干细胞是否存在？如果存在，它的分化等级和功能又是如何呢？其实早在2013年，布朗大学的Wentian Yang研究团队就已经在Nature发文证实，在关节软骨外膜旁的兰氏结构处（perichondrial groove of Ranvier），存在着一些cathepsin K阳性的 类似间质干细胞的分布【4】。文章进一步显示在小鼠的cathepsin K阳性细胞中，敲除Ptpn11会导致内生软骨瘤的形成，潜在证明了cathepsin K不仅仅标记成熟的破骨细胞而且很有可能标记骨膜中的成骨前体细胞或干细胞。

近期，骨膜干细胞的神秘面纱终于被揭开，来自于美国康奈尔大学威尔医学院的Matthew B. Greenblatt研究团队在Nature杂志发表了题为Discovery of a periosteal stem cell mediating intramembranous bone formation的研究快报，首次发现了骨膜干细胞并鉴定了其内成骨的特性，解决了困扰领域内以久的膜内成骨/软骨成骨化的干细胞归属问题。

图二 骨膜上间质干细胞来源的细胞

该课题组首先运用Cathepsin K cre 小鼠为主要模型，通过与Rosa-Mt/Mg 小鼠的交配，在体内建立了Cathepsin K cre 阳性细胞的“可视化”体系。共聚焦免疫荧光成像显示Cathepsin K 除了标记成熟的破骨细胞外，的确也可以标记部分骨膜上间质干细胞来源的细胞（图二），这与2013 年Nature论文（Wentian Yang et.al）关于的发现Cathepsin K cre 阳性细胞的描述所一致。接着， 作者安排了最关键一步的试验设计，通过鉴定小鼠骨骼干细胞的流式细胞分离方法，发现Cathepsin K 阳性骨膜细胞囊括了骨骼干细胞（CD200+CD105-）；骨，软骨，基质祖细胞(CD200-CD105-)和骨，软骨，基质前体细胞(CD200-CD105+)三大阶层。更为有意思的是：Cathepsin K 阳性骨膜干细胞不表达髓内间充质谱系细胞的经典标记蛋白（CD146;PDGF-alpha;Leptin receptor）。此外，骨膜干细胞还大量富集于小鼠新生颅骨的嵌合位置，暗示其主要作用于膜内成骨而非软骨成骨。

图三 单细胞测序验证骨膜干细胞

针对如此特异的Cathepsin K 阳性骨膜干细胞，作者谨慎地运用了一系列经典的干细胞鉴定策略去进一步深入肯定其“干”性。

1.在体外，对骨膜干细胞进行不同分化诱导培养，确定了其生成骨骼、软骨、脂肪的多重潜能；

2. 在体内，将骨膜干细胞移植到肾脏囊腔或是乳腺脂肪层中，进一步确定了其专属的成骨特性-膜内成骨；

3.也是最为关键的一步，将移植肾脏中的类骨形成物（GFP标记）进行再次流式细胞分离，得到的干细胞进行二次移植，肯定了其干细胞可以持续更新和再分化成不同阶层的特性（干细胞的金标准）。紧接着，也是该篇文章的画龙点睛之笔（个人认为也是深受Nature钟爱的特性之一）。作者运用了单细胞测序的新技术和最新生信解析方法（图三），进一步客观验证了骨膜干细胞的存在以及和其他谱系细胞的发育关联。

图四 骨折模型中验证了骨损伤诱导了Cathepsin K阳性细胞的扩增

最后，作者通过生理和病理模型肯定了Cathepsin K标记的骨膜干细胞在骨形成和再生中的功用。首先，通过敲除破骨细胞非表达的Osx基因确定了Cathepsin K阳性细胞在皮质骨生成中的特殊功用，并不影响到松质骨的累积。接着，在骨折模型中验证了骨损伤诱导了Cathepsin K阳性细胞的扩增，缺失成骨功能的Cathepsin K阳性细胞会直接导致骨折愈合不连（图四）。最后，作者进一步在人类的骨膜组织中也发现了与小鼠模型类似的Cathepsin K阳性骨膜干细胞并验证了其专属膜内成骨的特性。

总体上来说，该项工作的论述简洁明快，切入点新颖准确，针对骨骼发育中的核心问题：膜内成骨化和软骨成骨化的归属问题，巧妙借鉴前人的研究发现和方法，融合当前最热的技术门类，解答了困扰学术界多年以来的基本问题，值得大家思考和学习。本工作的通讯作者为Matthew B. Greenblatt 博士，康奈尔大学威尔医学院独立PI，是骨骼生物学领域近年来涌现的青年才俊之一。

参考文献：

1、Chan, C. K., Seo, E. Y., Chen, J. Y., Lo, D., McArdle, A., Sinha, R., … & Lu, W. J. (2015). Identification and specification of the mouse skeletal stem cell. Cell, 160(1), 285-298.

2、Worthley, D. L., Churchill, M., Compton, J. T., Tailor, Y., Rao, M., Si, Y., … & Gross, S. (2015). Gremlin 1 identifies a skeletal stem cell with bone, cartilage, and reticular stromal potential. Cell, 160(1), 269-284.

3、Chan, C. K., Gulati, G. S., Sinha, R., Tompkins, J. V., Lopez, M., Carter, A. C., … & Brewer, R. E. (2018). Identification of the Human Skeletal Stem Cell. Cell, 175(1), 43-56.

4、Yang, W., Wang, J., Moore, D. C., Liang, H., Dooner, M., Wu, Q., … & Neel, B. G. (2013). Ptpn11 deletion in a novel progenitor causes metachondromatosis by inducing hedgehog signalling. Nature, 499(7459), 491.

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