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lentiCRISPRv2 构建的经验汇总

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lentiCRISPRv2 构建的经验汇总


2017-12-15 07:00

美国麻省理工学院理学院的张锋教授,去年晋升为MIT史上最年轻华人终身教授。张锋教授是 CRISPR 的研究先驱,在 CRISPR 系统用于真核细胞(包括人类细胞)的基因编辑工具开发方面做出了最前沿的探索。由于这种基因组编辑技术更易于操作,而且具有更强的扩展性,近年来迅速成为了科研领域的宠儿。

简单介绍下 CRISPR-Cas9 系统,是细菌的一种获得性免疫系统,能通过 RNA 导向的核酸内切酶保护微生物免受外源核酸侵害。

这种免疫系统的独特机制使得它们成为简单易行的基因组工程工具。张锋团队改良的高滴度病毒的新载体(lentiCRISPRv2)也被广泛应用于生物科学实验中。

下面小编就介绍下 lentiCRISPRv2 质粒的构建经验与心得。

01

首先要根据找到的 sgRNA 订购 oligo

以下为目的基因 sgRNA 引物合成序列。sgRNA 引物设计请参考「5 分钟学会 cas9 基因敲除——原来设计方案如此简单

02

lentiCRISPRv2 构建方法

1. lentiCRISPRv2 载体线性化。

5 ug lentiCRISPRv2

3 ul FastDigest BsmBI (Fermentas)

3 ul FastAP (Fermentas)

6 ul 10X FastDigest Buffer

0.6ul 100 mM DTT

补 X ul ddH2O 至 60 ul 体系

37 °C 孵育 0.5 小时,每隔一段时间振荡一下并离心,以防液滴蒸发至管盖上。

2.载体线性化后,验证酶切效果。lentiCRISPRv2 质粒长度为 14873 bp,酶切后电泳图上可产生约 2kb 片段。弃掉这个片段,将大片段使用 QIAquick Gel 纯化回收 (见 1)。2 为原始质粒,隐约的三条带显示了质粒的三种状态:超螺旋,环形分子,线性分子。

3.将合成的 oligo 每一对进行退火。

1 ul Oligo 1 (100 µM)

1 ul Oligo 2 (100 µM)

1 ul 10X T4 Ligation Buffer (NEB)

6.5 ul ddH2O

0.5 ul T4 PNK (NEB M0201S)

总共 10 ul 体系,在 PCR 仪中按照以下 touch down 程序运行:

37°C,30 min

95°C ,5 min; 然后以 5°C /min 降至 25°C

4. 步骤 3 中退火引物按 1:200 用 RNase-free 水进行稀释。(实验心得:此步容易漏掉,其实非常重要,有些丁香园研友忽略此步,质粒构建未成功。)

5. 连接 sgRNA 载体。

X ul BsmBI 线性化质粒性 50 ng(步骤 3)

1 ul 稀释后退火引物(步骤 4)

5 ul 2X Quick Ligase Buffer (NEB)

X ul 补 ddH2O 至 10ul

最后再加入 1 ul Quick Ligase(NEB M2200S),总体系 11 ul。室温连接 10 min,也可根据情况适当延长时间。

6. 取连接产物,转染进 Stbl3 感受态细胞(张峰团队)。但是小编也发现丁香园研友使用 Stbl3 后未长菌,研友们很苦恼。其实小编选择的是 TOP10 感受态细胞进行转染的,对于 lentiCRISPRv2 的构建并无影响。lentiCRISPRv2 是氨苄抗性的哦。

7. 最后一步,测序。检验质粒构建成功与否,就在最后一步啦,记得要选择 human-u6 引物, 赶紧验证下你的质粒构建成功了吗?

学霸福利:手把手教你搞定 CRISPR/Cas9 系统操作,赶快戳阅读原文查看吧。

作者:非凡蓝色

图片来源:非凡蓝色

题图来源:丁香通

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