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PCR方法实验步骤和常见问题

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PCR方法实验步骤和常见问题

简介

聚合酶链式反应,简称PCR,是一种将几个或几十个拷贝数DNA片段扩增至上百万份拷贝的方法,这是迄今为止最为重要的技术之一。PCR技术的影响不仅仅局限于生物科学领域,几乎人人都可以感受到PCR所带来的改变,在亲子鉴定以及犯罪调查中PCR技术便有广泛应用。而人类基因组计划,这一具有划时代意义的测序工程,如果缺少了PCR技术手段则根本无法开始。

而PCR技术的发明同样有着一个传奇的故事。PCR技术的发明者Kary Banks Mullis讲述过他是如何捕捉到PCR的灵感的:1983年春天的一个晚上,他开着车行驶于加利福尼亚的群山公路之中,那蜿蜒的公路让他瞬间想到了PCR扩增的机制。之后他便不断的实验,最终取得了成功。而PCR技术的成功也让他获得了1993年的诺贝尔奖金。

PCR技术的原理相当简单,只要你明白体内DNA复制的机制便能轻松的理解。我们只是简化了体内的过程并让反应在PCR管中进行。我们知道DNA复制需要DNA模板,短的引物,聚合酶,dNTP以及聚合酶发挥活性的环境,我们优化得到适合DNA聚合酶反应的缓冲液并顺序加入dNTP,特异性的引物以及模板之后便能开始PCR。如果想要提高聚合酶的特异性,你可以尝试各种来源的DNA聚合酶或进行改造。

要开始PCR反应,首先需要将DNA模板进行变性来释放出单链的DNA,这通常需要94或98度的高温;之后将温度降低到50-65度让特异性的引物与单链DNA模板形结合,这一步称之为退火,退火温度取决于引物的特性如长度以及GC碱基的含量。退火之后需要将温度调整到适合DNA延伸的温度,这取决于你选用的DNA聚合酶:不同的DNA聚合酶有着不同的最适温度。当上述的过程完成便称为一个循环。通常PCR反应包含有20-40个循环,这样理论上你可以得到220-40 的DNA拷贝数。

试剂

DNA模板,与特定DNA模板结合的引物,去离子水,商业化的DNA聚合酶以及缓冲液,dNTP, MgSO4(可选)和DMSO(可选)

步骤

假设我们已经有了各种试剂和PCR仪,那我们便可以开始PCR实验:将各种试剂混合并按照说明书设置PCR反应。一般PCR循环如下:

  1. 起始步骤:这对于热启动PCR而言是必须的,将反应混合液加热至94-98度以激活DNA聚合酶。这一步的时间取决于所选用的DNA聚合酶。
  2. 变性步骤:DNA本身是双链结构,而DNA扩增需要引物与单链DNA模板相结合。在这一步,反应混合液被加热至94-98度保持20-30秒以破坏双链间的氢键以便释放出单链DNA。这是PCR循环中的第一步。
  3. 退火步骤:变性之后,DNA模板以单链的形式在反应混合液中存在。因为反应体系中的引物与DNA模板互补,当反应温度降至50-65度时,引物与互补的序列形成氢键。退火温度主要取决于引物的Tm值,通常比引物Tm值低3-5度。这一步通常维持20-40秒,而聚合酶会结合至引物-模板双链处开始DNA合成。
  4. 延伸步骤:在这一步,DNA聚合酶开始DNA合成,因此这一步的温度选取的是DNA聚合酶的最优温度。通常我们选用72度,但某些DNA聚合酶的最适温度是68度。这一步与体内的DNA复制很相似:DNA聚合酶按照碱基互补规律将dNTPs加到引物的3’末端最终得到新的DNA双链片段。延伸时间取决于目的DNA片段的长度和DNA聚合酶的合成能力。一般而言DNA聚合酶每60秒能够合成1kb长度的DNA。
  5. 第2步至第4步称为一个循环:每次循环之后DNA的量均是前一次的两倍。通常一次PCR反应进行30-35个循环。在前几轮的PCR循环过程中PCR产物的量以指数速率增长,但是到了反应后期随着dNTPs和引物的量的减少以及DNA聚合酶的失活,反应速率逐渐下降,因此PCR反应的产量也受到了限制。
  6. 最后的延伸步骤:当30-35个循环结束后,我们通常会以68-74度延伸5-10分钟,这是希望使反应体系中残留的单链DNA全部反应完毕。
  7. 维持时间:通常我们设置4-10度为反应后PCR产物的保存温度。
PCR反应开始前的准备工作

PCR反应开始前,你需要准备好DNA模板(基因组DNA或者反转录制备的cDNA),特异性的引物(手动设计或利用软件设计)并选择合适的商业化DNA聚合酶(根据实验的目的不同做出决定)。

  1. DNA聚合酶的选择。市面上有多种DNA聚合酶可供选择,他们的特性也各有不同。因此你需要选择最适合自己实验需要的产品。通常我们将DNA聚合酶分为高保真性聚合酶和普通的Taq聚合酶。如果你希望得到没有任何突变的PCR产物,那应当选择高保真聚合酶。若你只是希望判断特异性序列的存在与否,那普通的Taq聚合酶已经足够。另外要注意的一点是,进行T载体连接的时候,要了解高保真的聚合酶所得的产物是没有A末端的,因此你在T载体连接之前需要进行加A反应。或者直接选用普通的Taq聚合酶。
  2. 引物。引物特异性会影响到PCR反应成功的可能性,好的引物设计对PCR成功至关重要。设计引物时,有以下几条原则需要谨慎考虑:
    1. 引物长度。通常PCR引物长度在18-22个碱基之间。这对引物的特异性以及退火温度而言均已足够。
    2. 解链温度Tm。Tm值的定义是使得一半双链DNA解螺旋成为单链DNA的温度。引物的Tm值通常要在52-58度之间。
    3. GC含量。最适合的GC含量为40-60%。

    就目前而言很多软件都可以用来设计引物,如primer5和Oligo。通常这些软件设计得到的引物均可以满足需要。

问题解答
  1. 无条带
    1. 反应体系错误。重新配置反应体系确保各种试剂加入的量没有问题。
    2. PCR程序出错。检测PCR仪程序是否正确。
    3. DNA胶问题。DNA凝胶电泳时加入阳性对照。
    4. 退火温度不合适。以2度为梯度设计梯度PCR反应优化退火温度。
    5. DNA模板量太少。增加DNA模板量。
    6. 引物错误。利用BLAST检查引物特异性或重新设计引物。
    7. DNA模板中存在抑制剂。确保DNA模板干净
    8. 模板有复杂结构。加入DMSO,BSA或者甜菜碱。可尝试递减PCR。
  2. PCR产物量过少
    1. 退火温度不合适。以2度为梯度设计梯度PCR反应优化退火温度。
    2. DNA模板量太少。增加DNA模板量。
    3. PCR循环数不足。增加反应循环数。
    4. 引物量不足。增加体系中引物含量。
    5. 延伸时间太短。以1kb/分钟的原则设置延伸时间。
    6. 变性时间过长。变性时间过长会导致DNA聚合酶失活。
    7. DNA模板中存在抑制剂。确保DNA模板干净
  3. 有杂带
    1. 复制提前终止。使用非热启动的聚合酶时常有发生。冰上准备反应体系或采用热启动聚合酶。
    2. 引物退火温度过低。以2度为梯度设计梯度PCR反应优化退火温度。
    3. 反应缓冲液未完全融化或未充分混匀。确保反应缓冲液融化完全并彻底混匀。
    4. 引物特异性差。利用BLAST检查引物特异性或重新设计引物。
    5. 引物量过多。减少反应体系中引物的用量。
    6. 模板量过多。质粒DNA的用量应<50ng,而基因组DNA则应<200ng。
    7. 外源DNA污染。确保操作的洁净。
  4. 条带弥散
    1. 复制提前终止。使用非热启动的聚合酶时常有发生。冰上准备反应体系或采用热启动聚合酶。
    2. 模板量过多。质粒DNA的用量应<50ng,而基因组DNA则应<200ng。
    3. 酶量过多。减少DNA聚合酶的使用量。
    4. 循环数过多。减少反应循环数至30.
    5. 引物浓度不够优化。对引物进行梯度稀释重复PCR反应。
    6. 引物错误。利用BLAST检查引物特异性或重新设计引物。
  5. 阴性对照出现条带
    1. 试剂,枪头,工作台污染。使用全新的试剂和枪头,对工作台进行清洁。
  6. 条带大小与理论不符
    1. 污染。使用全新的试剂和枪头,对工作台进行清洁。
    2. 模板或引物使用错误。更换引物和模板。
    3. 基因亚型。对研究的基因进行序列分析和BLAST研究。

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