lentiCRISPRv2 构建的经验汇总

美国麻省理工学院理学院的张锋教授，去年晋升为MIT史上最年轻华人终身教授。张锋教授是 CRISPR 的研究先驱，在 CRISPR 系统用于真核细胞(包括人类细胞)的基因编辑工具开发方面做出了最前沿的探索。由于这种基因组编辑技术更易于操作，而且具有更强的扩展性，近年来迅速成为了科研领域的宠儿。

简单介绍下 CRISPR-Cas9 系统，是细菌的一种获得性免疫系统，能通过 RNA 导向的核酸内切酶保护微生物免受外源核酸侵害。

这种免疫系统的独特机制使得它们成为简单易行的基因组工程工具。张锋团队改良的高滴度病毒的新载体（lentiCRISPRv2）也被广泛应用于生物科学实验中。

下面小编就介绍下 lentiCRISPRv2 质粒的构建经验与心得。

01

首先要根据找到的 sgRNA 订购 oligo

以下为目的基因 sgRNA 引物合成序列。sgRNA 引物设计请参考「5 分钟学会 cas9 基因敲除——原来设计方案如此简单」

02

lentiCRISPRv2 构建方法

1. lentiCRISPRv2 载体线性化。

5 ug lentiCRISPRv2

3 ul FastDigest BsmBI （Fermentas）

3 ul FastAP （Fermentas）

6 ul 10X FastDigest Buffer

0.6ul 100 mM DTT

补 X ul ddH2O 至 60 ul 体系

37 °C 孵育 0.5 小时，每隔一段时间振荡一下并离心，以防液滴蒸发至管盖上。

2.载体线性化后，验证酶切效果。lentiCRISPRv2 质粒长度为 14873 bp，酶切后电泳图上可产生约 2kb 片段。弃掉这个片段，将大片段使用 QIAquick Gel 纯化回收 （见 1）。2 为原始质粒，隐约的三条带显示了质粒的三种状态：超螺旋，环形分子，线性分子。

3.将合成的 oligo 每一对进行退火。

1 ul Oligo 1 （100 µM）

1 ul Oligo 2 （100 µM）

1 ul 10X T4 Ligation Buffer （NEB）

6.5 ul ddH2O

0.5 ul T4 PNK （NEB M0201S）

总共 10 ul 体系，在 PCR 仪中按照以下 touch down 程序运行：

37°C,30 min

95°C ,5 min; 然后以 5°C /min 降至 25°C

4. 取步骤 3 中退火引物按 1:200 用 RNase-free 水进行稀释。（实验心得：此步容易漏掉，其实非常重要，有些丁香园研友忽略此步，质粒构建未成功。）

5. 连接 sgRNA 载体。

X ul BsmBI 线性化质粒性 50 ng（步骤 3）

1 ul 稀释后退火引物（步骤 4）

5 ul 2X Quick Ligase Buffer （NEB）

X ul 补 ddH2O 至 10ul

最后再加入 1 ul Quick Ligase（NEB M2200S），总体系 11 ul。室温连接 10 min，也可根据情况适当延长时间。

6. 取连接产物，转染进 Stbl3 感受态细胞（张峰团队）。但是小编也发现丁香园研友使用 Stbl3 后未长菌，研友们很苦恼。其实小编选择的是 TOP10 感受态细胞进行转染的，对于 lentiCRISPRv2 的构建并无影响。lentiCRISPRv2 是氨苄抗性的哦。

7. 最后一步，测序。检验质粒构建成功与否，就在最后一步啦，记得要选择 human-u6 引物， 赶紧验证下你的质粒构建成功了吗？

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作者：非凡蓝色

图片来源：非凡蓝色

题图来源：丁香通

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