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shRNA慢病毒载体构建 – 哔哩哔哩

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shRNA:小发卡或短发卡RNA(a small hairpin RNA or short hairpin RNA,shRNA)是一段具有紧密发卡环(tight hairpin turn)的RNA序列,常被用于RNA干扰沉默靶基因的表达。利用载体把shRNA导入细胞,载体中的U6启动子确保shRNA总是表达;shRNA的发卡结构可被细胞机制切割成siRNA,然后siRNA结合到RNA诱导沉默复合物上(RNA-induced silencing complex,RISC),该复合物能够结合到目的mRNAs并将其降解。

本文有以下几节构成:

1.shRNA设计总原则

2.目的序列的获取

3.shRNA设计的引物序列

4.载体合成

一.shRNA设计原则:

注:此部分为up主将各个平台的学习资料总结整合而成,毕竟知识点没法原创哈!只有教学过程是原创的。

1.克隆到shRNA表达载体 中的shRNA包括两个短反向重复序列,中间由一茎环(loop)序列分隔的,组成发夹结构,由polⅢ启动子控制。随后在连上5-6个T作为RNA聚合酶Ⅲ的转录终止子。

2.两个互补的寡核苷酸 两端须带有限制性酶切位点,但是具体的酶切位点,需要根据所选用的骨架载体来确定

3.Stratagene发现29个寡核苷酸 较之原先推荐的23个寡核苷酸可以更有效的抑制目的基因。

4.在启动子下游的酶切位点下方紧连一个C,使插入片段和启动子有一定空间间隔以确保转录 的发生。

5.ShRNA目的序列的第一个碱基必须是G以确保RNA聚合酶转录。如果选择的目的序列不以G开头,必须在紧连正义链的上游加一个G。

6.ShRNA插入片段中的茎环应当靠近寡核苷酸的中央。不同大小和核苷酸序列的茎环都被成功的运用过。其中包含一个独特的限制性酶切位点的茎环利于检测带有shRNA插入片段的克隆。在比较了众多不同长度和序列的茎环,有报道认为5’TCAAGA3’序列最为有效,但是也需要根据载体情况而定,最常用的还是5′CTCAGA3′

7.5-6个T必须放置在shRNA插入片段尾部以确保RNA聚合酶III终止转录(stop)。

8.在正义链和反义链序列上不能出现连续3个或以上的T。这可能导致shRNA转录的提前终止。

9.从转录本(mRNA)的AUG起始密码开始,寻找“AA或者NA”二连序列,并记下其3’端的19个碱基序列,作为潜在的siRNA靶位点。正义链和反义链都采用这19个碱基(不包括AA或者NA重复)来设计。

10.尽量选择CDS区序列为靶向序列。

二.靶点序列的选择

方法一:sigma网站直接获取

Sigma公司做了一个针对人和小鼠的shRNA库,而且部分基因的shRNA序列经过验证,因此直接使用Sigma公司已验证过的RNAi序列最为方便。

点开网站,https://www.sigmaaldrich.cn/CN/zh

输入基因名AFAP1-AS1,

sigma网站结果

发现sigma网站上并没有合适的sh序列,只有si,没有已经验证过的sh序列,因此可以换另一种方法。本基因并没有找到,如果有已经验证过的序列,则直接把序列搬家即可,非常的简单。

下面介绍一种根据序列来设计sh敲低靶点的方法!

方法二:Life Technologies网站

打开网站Invitrogen Block-iT RNAi Designer (thermofisher.com),在shRNA框内输入accession number或者Nucleotide sequence,这两个信息可以在NCBI网站查到。NCBI中的每一条基因序列都有一个accession number,是数据库接受这条序列的时候给的,是一个唯一的编,就像人的身份证号码一样。

在NCBI→gene→输入AFAP1-AS1,在网页AFAP1-AS1 AFAP1 antisense RNA 1 [Homo sapiens (human)] – Gene – NCBI (nih.gov)中,往下拉,找到它的accession为NR_026892.1

NCBI结果图

,将此编号输入Life Technologies网站的框,下拉点击RNAi design

Life Technologies网站搜索结果图

即可得到不同的target sequence。

选取原则:1.避免选取GGG和CCC等高GC序列 ;2.ShRNA目的序列的第一个碱基必须是G以确保RNA聚合酶转录。如果选择的目的序列不以G开头,必须在紧连正义链的上游加一个G。根据Rank评星,从中选取合适靶点序列(一般选择3~5条,不同位置各一条);3.尽量不要选择有AAA或者TTT的靶点!

选择完成后,点击Design shRNA Oligos:

然后在“Default Loop Sequence”选择合适的序列,在“Custom Loop Sequence”处输入合适的loop环序列,点击Design,即得shRNA序列。

sh的序列应包括:

Forward:酶切位点1+目的序列+CTCGAG(loop环)+目的序列反向重复序列+TTTTT(终止转录)

Reverse:酶切位点2+目的序列+CTCGAG(loop环)+目的序列反向重复序列

目前总结到的常见loop环序列:

CTCGAG,TTCAAGAGA,5’TCAAGAG3’序列

需注意:如果要构建到慢病毒载体上,合成出去的shRNA引物会根据载体有些不一样,本组用的载体是pLKO.1载体,根据师姐的经验,选用CTCGAG序列,点击design。

三.引物订购

pLKO.1载体的U6启动子可以保证RNA高效转录,但是酶切位点比较单一,仅有AgeI和EcoRI。同时,sigma公司常用的骨架载体也是这个。

pLKO.1载体模式图

shRNA序列一般为:

Forward oligo:

5’ CCGG—21bp sense—CTCGAG—21bp antisense—TTTTTG 3’

Reverse oligo:

5’ AATTCAAAAA—21bp sense—CTCGAG—21bp antisense 3’

①CCGG和AATT是酶切位点的残端,AgeI,EcoRI。

②TTTTT(一般是5~6个T)是为了终止转录

因此,只要根据life Technologies网站的结果,换一下linker就可以。针对上述life Technologies网站中得到的sense—CTCGAG—antisense 序列,进行以下检查:1.在正义链和反义链序列上不能出现连续3个或以上的T,这可能导致shRNA转录的提前终止。2.尽量不要选择GC含量高的序列,使得引物不易变性成单链,影响实验结果。

以本次结果的第一个序列为例,得到

上游引物1:

5′- CCGGGCACACGGCTTATAATTAATCCTCGAGGATTAATTATAAGCCGTGTGCTTTTTG -3′

下游引物1:

5’ -AATTCAAAAAGCACACGGCTTATAATTAATCCTCGAGGATTAATTATAAGCCGTGTGC-3′

此外需要对RNA序列进行验证,

验证1:以DNAMAN验证RNA二级结构

以F1为例,依次点击sequence→secondnary structure→current可以得到如下的结果

DNAMAN结果

验证2:以snapgene软件分析引物是否匹配

依然以第一对引物为例,打开snapgene软件,新建DNA序列,输入正向引物的序列“上游引物1”。而后点击“引物→添加引物”,将“下游引物1”作为引物序列输入,可得到

snapgene结果,可见上下游引物是匹配的。

四.载体构建

使用上述引物,将RNA扩成cDNA后进行DNA连接,一个以pLKO.1为骨架的慢病毒载体就构建好了。

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