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分子克隆的正确打开方式 | 质粒敲减及双酶切方案(四)

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在前面的 分子克隆的引物设计介绍中,我们通过Sigma网站获得了DicerI的是shRNA序列:CCGGGCTGGGATGATGGTAAGAGAACTCGAGTTCTCTTACCATCATCCCAGCTTTTTG。今天就为大家介绍一下以PLKO.1质粒载体构建shRNA 质粒载体,进行PLKO.1质粒载体酶切时,选择限制性内切酶EcoRI 与 AgeI。

PLKO.1质粒载体构架

Forward oligo

5’CCGG—21bp sense—CTCGAG—21bp antisense—TTTTTG-3’

Reverse oligo

5’AATTCAAAAA—21bp sense—CTCGAG—21bp antisense-3’

因此根据载体构架合成的DicerI shRNA引物序列为

Forward oligo

5’-CCGGGCTGGGATGATGGTAAGAGAACTCGAGTTCTCTTACCATCATCCCAGCTTTTTG-3’

Reverse oligo

5’-AATTCAAAAAGCTGGGATGATGGTAAGAGAACTCGAGTTCTCTTACCATCATCCCAGC-3’

1

首先将合成的引物序列进行退火,合成双链。

退火体系为:

  • 5 μL Forward oligo

  • 5 μL Reverse oligo

  • 5 μL 10x NEB buffer 2

  • 35 μL ddH2O

2

将PLKO.1质粒进行酶切消化为线性载体。

由于选择为双酶切,可以有两种方案:

方案一

先进行AgeI酶切,再进行EcoRI酶切。

方案二

同时进行AgeIEcoRI酶切。

可在NEB公司网站查询双酶切温度条件。

a

进入NEB网站,进入产品资料,点击限制性内切酶。

b

进入网页后,在右侧侧栏选择Double Digest Finder。

c

输入两种限制性内切酶后发现,两种酶酶切温度均为37度,但是在不同的NEB Buffer中具有不同活性。

d

为了选择具有相同活性的NEB Buffer,在对话框中可以选择高保真版的限制性内切酶-AgeI-HF与EcoRI-HF,两者在cut smart buffer 缓冲液中活性均为100%。

制定酶切体系:

  • 6 μg pLKO.1

  • 5 μL 10x cut smart buffer

  • 1 μL AgeI-HF

  • 1 μL EcoRI-HF

  • ddH2O补至50 μL

3

37度酶切两小时以上,间隔震荡。

4

通过琼脂糖电泳获得线性化质粒,同时进行纯化回收。

5

将退火产物与线性化质粒进行T4连接酶连接,4度连接过夜。

  • 2μL退火产物

  • 20ng 线性化pLKO.1质粒

  • 2μL 10x NEB T4 DNA ligase buffer

  • 1μL NEB T4 DNA连接酶

  • ddH2O补至20μL

6

连接质粒进行转化,涂板,调取单克隆进行测序,就可以验证目的引物是否连接成功啦。

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