在前面的 分子克隆的引物设计介绍中，我们通过Sigma网站获得了DicerI的是shRNA序列：CCGGGCTGGGATGATGGTAAGAGAACTCGAGTTCTCTTACCATCATCCCAGCTTTTTG。今天就为大家介绍一下以PLKO.1质粒载体构建shRNA 质粒载体，进行PLKO.1质粒载体酶切时，选择限制性内切酶EcoRI 与 AgeI。

PLKO.1质粒载体构架

Forward oligo

5’CCGG—21bp sense—CTCGAG—21bp antisense—TTTTTG-3’

Reverse oligo

5’AATTCAAAAA—21bp sense—CTCGAG—21bp antisense-3’

因此根据载体构架合成的DicerI shRNA引物序列为

Forward oligo

5’-CCGGGCTGGGATGATGGTAAGAGAACTCGAGTTCTCTTACCATCATCCCAGCTTTTTG-3’

Reverse oligo

5’-AATTCAAAAAGCTGGGATGATGGTAAGAGAACTCGAGTTCTCTTACCATCATCCCAGC-3’

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首先将合成的引物序列进行退火，合成双链。

退火体系为：

• •

  5 μL Forward oligo

• •

  5 μL Reverse oligo

• •

  5 μL 10x NEB buffer 2

• •

  35 μL ddH2O

2

将PLKO.1质粒进行酶切消化为线性载体。

由于选择为双酶切，可以有两种方案：

方案一

先进行AgeI酶切，再进行EcoRI酶切。

方案二

同时进行AgeI与EcoRI酶切。

可在NEB公司网站查询双酶切温度条件。

a

进入NEB网站，进入产品资料，点击限制性内切酶。

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进入网页后，在右侧侧栏选择Double Digest Finder。

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输入两种限制性内切酶后发现，两种酶酶切温度均为37度，但是在不同的NEB Buffer中具有不同活性。

d

为了选择具有相同活性的NEB Buffer，在对话框中可以选择高保真版的限制性内切酶-AgeI-HF与EcoRI-HF，两者在cut smart buffer 缓冲液中活性均为100%。

制定酶切体系：

• •

  6 μg pLKO.1

• •

  5 μL 10x cut smart buffer

• •

  1 μL AgeI-HF

• •

  1 μL EcoRI-HF

• •

  ddH2O补至50 μL

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37度酶切两小时以上，间隔震荡。

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通过琼脂糖电泳获得线性化质粒，同时进行纯化回收。

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将退火产物与线性化质粒进行T4连接酶连接，4度连接过夜。

• •

  2μL退火产物

• •

  20ng 线性化pLKO.1质粒

• •

  2μL 10x NEB T4 DNA ligase buffer

• •

  1μL NEB T4 DNA连接酶

• •

  ddH2O补至20μL。

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连接质粒进行转化，涂板，调取单克隆进行测序，就可以验证目的引物是否连接成功啦。