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【分子生物学】分子克隆方法|基因克隆|cDNA克隆 – 知乎

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【分子生物学】分子克隆方法|基因克隆|cDNA克隆

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cDNA(complementary DNA)即互补DNA或拷贝DNA。

任何cDNA克隆方法的关键环节都是以mRNA为模板利用反转录酶(reverse transcriptase)合成cDNA的第一条链,反转录酶没有引物不能起始DNA的合成,真核生物多利用oligo(dT)作为引物。

利用核糖核酸酶H(RNase H)降解mRNA,从而形成单链DNA。

第二条链的合成需要采用切口平移(nick translation)的方法以残留的RNA片段为引物以第一条链为模板合成。

切口平移就是同时进行切口前DNA的移除和切口后DNA的合成,用于切口平移的酶是大肠杆菌的DNA聚合酶Ⅰ。

末端脱氧核苷酰转移酶(terminal deoxynucleotidyl transferase)(末端转移酶)和某种脱氧核苷三磷酸在cDNA上创建黏性末端,使cDNA与载体连接。

进行cDNA连接的载体选择取决于检测阳性克隆(带有目的cDNA克隆)的方法,质粒和噬菌体均可,阳性克隆要用菌落杂交。

实验中常常得到一些非全长的cDNA,可通过cDNA末端快速扩增(rapid amplification of cDNA end,RACE)可将缺失cDNA补齐。

该图为5′-RACE实验时,先制备含有目的mRNA的RNA和5’端缺失的cDNA,利用反转录酶延伸cDNA,后末端转移酶和dCTP在cDNA3′-末端加上oligo(dC)尾。用oligo(dG)引发第二条链的合成,产生一个双链cDNA。

编辑于 2021-04-07 08:58

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