口腔医学小站

口腔文献阅读与资源分享

常用蛋白标签对比 – 知乎

| 暂无评论

蛋白标签(protein tag)是指利用DNA体外重组技术,与目的蛋白一起融合表达的一种多肽或者蛋白,以便于目的蛋白的表达、检测、示踪和纯化等。

常用的蛋白标签有6xHIS、Flag、GST、Myc、eGFP/eCFP/eYFP/mCherryeGFP、HA、SUMO等。

His6:

His6是指六个组氨酸残基组成的融合标签,可插入在目的蛋白的C末端或N末端。当某一个标签的使用,一是能构成表位利于纯化和检测;二是构成独特的结构特征(结合配体)利于纯化。组氨酸残基侧链与固态的镍有强烈的吸引力,可用于固定化金属螯合层析(IMAC),对重组蛋白进行分离纯化。

使用His-tag有下面优点:

1.标签的分子量小,只有~0.84KD,而GST和蛋白A分别为~26KD和~30KD,一般不影响目标蛋白的功能;

2.His标签融合蛋白可以在非离子型表面活性剂存在的条件下或变性条件下纯化,前者在纯化疏水性强的蛋白得到应用,后者在纯化包涵体蛋白时特别有用,用高浓度的变性剂溶解后通过金属螯和亲和层析去除杂蛋白,使复性不受其它蛋白的干扰,或进行金属螯和亲和层析复性;

3.His标签融合蛋白也被用于蛋白质-蛋白质、蛋白质-DNA相互作用研究;

4.His标签免疫原性相对较低,可将纯化的蛋白直接注射动物进行免疫制备抗体

5.可应用于多种表达系统,纯化的条件温和;

6.可以和其它的亲和标签一起构建双亲和标签。

Flag:

Flag标签蛋白为编码8个氨基酸的亲水性多肽(DYKDDDDK),同时载体中构建的Kozak序列使得带有FLAG的融合蛋白在真核表达系统中表达效率更高。

FLAG作为标签蛋白,其融合表达目的蛋白后具有以下优点:

1.FLAG作为融合表达标签,其通常不会与目的蛋白相互作用并且通常不会影响目的蛋白的功能、性质,这样就有利用研究人员对融合蛋白进行下游研究。

2.融合FLAG的目的蛋白,可以直接通过FLAG进行亲和层析,此层析为非变性纯化,可以纯化有活性的融合蛋白,并且纯化效率高。

3.FLAG作为标签蛋白,其可以被抗FLAG的抗体识别,这样就方便通过Western Blot、ELISA等方法对含有FLAG的融合蛋白进行检测、鉴定。

4.融合在N端的FLAG,其可以被肠激酶切除(DDDK),从而得到特异的目的蛋白。因此现FLAG标签已广泛的应用于蛋白表达、纯化、鉴定、功能研究及其蛋白相互作用等相关领域。

MBP:

MBP(麦芽糖结合蛋白)标签蛋白大小为40kDa,由大肠杆菌K12的malE基因编码。MBP可增加在细菌中过量表达的融合蛋白的溶解性,尤其是真核蛋白。MBP标签可通过免疫分析很方便地检测。有必要用位点专一的蛋白酶切割标签。如果蛋白在细菌中表达,MBP可以融合在蛋白的N端或C端。

纯化:融合蛋白可通过交联淀粉亲和层析一步纯化。结合的融合蛋白可用10mM麦芽糖在生理缓冲液中进行洗脱。结合亲和力在微摩尔范围。一些融合蛋白在0.2% Triton X-100或0.25% Tween 20存在下不能有效结合,而其他融合蛋白则不受影响。 缓冲条件为pH7.0到8.5,盐浓度可高达1M,但不能使用变性剂。如果要去除MBP融合部分,可用位点特异性蛋白酶切除。

检测:可用MBP抗体或表达的目的蛋白特异性抗体检测。

GST:

GST(谷胱甘肽巯基转移酶) 标签蛋白本身是一个在解毒过程中起到重要作用的转移酶,它的天然大小为26KD。将它应用在原核表达的原因大致有两个,一个是因为它是一个高度可溶的蛋白,希望可以利用它增加外源蛋白的可溶性;另一个是它可以在大肠杆菌中大量表达,起到提高表达量的作用。GST融合表达系统广泛应用于各种融合蛋白的表达,可以在大肠杆菌和酵母菌等宿主细胞中表达。结合的融合蛋白在非变性条件下用10mM 还原型谷胱甘肽洗脱。在大多数情况下,融合蛋白在水溶液中是可溶的,并形成二体。GST标签可用酶学分析或免疫分析很方便的检测。标签有助于保护重组蛋白免受胞外蛋白酶的降解并提高其稳定性。在大多数情况下GST融合蛋白是完全或部分可溶的。

纯化:该表达系统表达的GST标签蛋白可直接从细菌裂解液中利用含有还原型谷胱甘肽琼脂糖凝胶(Glutathionesepharose)亲和树脂进行纯化。GST标签蛋白可在温和、非变性条件下洗脱,因此保留了蛋白的抗原性和生物活性。GST在变性条件下会失去对谷胱甘肽树脂的结合能力,因此不能在纯化缓冲液中加入强变性剂如:盐酸胍或尿素等。

如果要去除GST融合部分,可用位点特异性蛋白酶切除。

检测:可用GST抗体或表达的目的蛋白特异性抗体检测。

HA

HA标签蛋白,标签序列YPYDVPDYA,源于流感病毒的红细胞凝集素表面抗原决定簇,9个氨基酸,对外源靶蛋白的空间结构影响小, 容易构建成标签蛋白融合到N端或者C端。易于用Anti-HA抗体检测和ELISA检测。

用HA peptide可实现带HA tag的蛋白洗脱,0.15M Arginine-HCl缓冲液, pH3.0可实现蛋白纯化beads 的重生。

Myc

Myc标签蛋白,是一个含11个氨基酸的小标签,标签序列Glu-Gln-Lys-Leu-Ile-Ser-Glu-Glu-Asp-Leu,这11个氨基酸作为抗原表位表达在不同的蛋白质框架中仍可识别其相应抗体。Myc tag已成功应用在 Western-blot杂交技术、免疫沉淀和流式细胞计量术中, 可用于检测重组蛋白质在靶细胞中的表达。

eGFP/eCFP/eYFP/mCherry

分别是增强型绿色荧光蛋白/增强型黄绿色荧光蛋白/增强型黄绿色荧光蛋白/单体红色荧光蛋白,具有不同的激发波长发射波长为,均由野生型荧光蛋白通过氨基酸突变和密码子优化而来。就eGFP而言,相对于GFP,其荧光强度更强、荧光性质更稳定。同时载体中构建的Kozak序列使得含有eGFP的融合蛋白在真核表达系统中表达效率更高。mCherry是从DsRed演化来的性能最好的一个单体红色荧光蛋白,可以和GFP系列荧光蛋白共用,实现多色标记体内、外实验表明,mCherry在N端和C端融合外源蛋白时,荧光蛋白活性和被融合的目标蛋白功能相互没有明显影响。

这些荧光标签蛋白,其融合表达目的蛋白后具有以下优点:

1.不用破碎组织细胞和不加任何底物,直接通过荧光显微镜就能在活细胞中发出绿色荧光,实时显示目的基因的表达情况,而且荧光性质稳定,被誉为活细胞探针。

2.其自发荧光,不需用目的基因的抗体或原位杂交技术就可推知目的基因在细胞中的定位等情况。

3.同时细胞内的其它产物不会干扰标签蛋白检测,从而使其检测更显得快速、简便、灵敏度高而且重现性。

4.其低消耗、高灵敏度检测,十分适用于高通量的药物筛选。因此现eGFP 表达标签被广泛地应用于基团表达调控、转基因功能研究、蛋白在细胞中的功能定位、迁移变化及药物筛选等方面。

5.mCherry红色荧光蛋白在标记病毒颗粒,研究病毒和宿主细胞之间更有得天独厚的优势。如用mRFP或mCherry标记HIV病毒颗粒,研究H1V和宿主细胞问的相互作用以及HIV侵染宿主细胞的过程.用mRFP标记慢病毒颗粒,研究慢病毒在小鼠体内的复制过程等。

Strep-II Tag

Strep-tag技术开发的原理是众所周知的生物素(biotin)和抗生物素蛋白链菌素(streptavidin)之间的结合反应。为了将这种牢固的相互作用用于蛋白质纯化用途,研究者们发现需要一个肽,该肽与重组蛋白质融合后,能够结合在streptavidin的生物素结合口袋,从而作为纯化tag。

由8个氨基酸(Trp-Ser-His-Pro-Gln-Phe-Glu-Lys)构成的短序列并称之为Strep-tag II。因为它的分子量很小,只有1.06kDa,所以不会遮盖融合蛋白中其他的蛋白表位和结构域,更不容易改变融合蛋白的功能、分泌或是运输。

Avi Tag

AviTag标签蛋白是一个15 个氨基酸的短肽,具有一个单生物素化赖氨酸位点,与已知天然可生物素化序列完全不同,可以加在目标蛋白的N端和C端。融合表达后,可被生物素连接酶生物素化,为了纯化重组蛋白选用低亲和性的单体抗生物素蛋白或抗生物素蛋白衍生物,除了用于蛋白质分离纯化,还用于蛋白质相互作用研究。

Avi Tag标签系统具有以下几大优点:

1.无论在体外或者体内,几乎所有的蛋白都可以在一个独特的Avi Tag位点轻易且有效地被生物素化;

2.生物素化是通过酶和底物的反应来实现,反应条件相当温和而且标记的专一性极高;

3.生物素AviTag只有15个氨基酸,对蛋白空间结构的影响非常小。

SNAP-Tag

SNAP-Tag是新一代的蛋白标签技术,不仅专一性极高而且稳定,最大的优点是适用于多种环境下的蛋白质检测与纯化,如活细胞内、溶液中、或固态相(如SDS-PAGE gels)等。

SNAP-Tag是从人的O6-甲基鸟嘌呤-DNA甲基转移(O6-alkylguanine-DNA-alkyltransferase)获得。无论体内还是体外,SNAP-Tag都能与底物高特异性地共价结合,使蛋白标记上生物素或荧光基团(如荧光素和若丹明)。SNAP所带的活性巯基位点接受了苯甲基鸟嘌呤所携带的侧链苯甲基基团,释放出了鸟嘌呤。这种新的硫醚键共价结合使SNAP所带的目的蛋白携带上了苯甲基基团所带的标记物。苯甲基鸟嘌呤在生化条件下稳定,并且没有其他蛋白会和这类物质作用,所以SNAP标签反应是高特异的。

检测:生物素或各种颜色荧光的底物(如荧光素、若丹明)可渗透进入细胞,方便快捷地进行活细胞内SNAP-Tag融合蛋白的标记与检测。它们也可特异性地标记大肠杆菌,酵母和哺乳动物等细胞抽提液或已经纯化的蛋白液中的SNAP-tag融合蛋白。

将纯化的或未纯化的SNAP-Tag融合蛋白与表面固定了苯甲基鸟嘌呤的基质混合,蛋白即可特异与底物作用,形成共价键,融合蛋白间接被固定在了基质表面上,可以达到更方便快捷地研究蛋白功能或纯化蛋白的目的。

Halo Tag

HaloTag标签蛋白是一种脱卤素酶的遗传修饰衍生物,可与多种合成的HaloTag配基有效地共价结合。这个分子量为33KDa的单体蛋白能融合在重组蛋白的N端或C 端,并在原核和真核系统中表达。

HaloTag配基是小分子化学物,能够在体外或体内与HaloTag蛋白共价结合(区别于一般tag的非共价结合,其强结合facilitate强的洗脱作用→以去除非特异信号)。这些配基由两个关键组分组成:(1)一个通用的HaloTag反应联结子,结合HaloTag蛋白;(2)一个功能基团,例如荧光染料或亲和媒介。

能够共价和特异性结合多种合成的报告基团和亲和配基的特性,使得HaloTag蛋白能够用于检测和亲和结合或固相化固定目的蛋白。

SUMO

SUMO标签蛋白是一种小分子泛素样修饰蛋白(Small ubiquitin-likemodifier),是泛素(ubiquitin)类多肽链超家族的重要成员之一。在一级结构上,SUMO与泛素只有18%的同源性,然而两者的三级结构及其生物学功能却十分相似。研究发现SUMO可以作为重组蛋白表达的融合标签和分子伴侣,不但可以进一步提高融合蛋白的表达量,且具有抗蛋白酶水解以及促进靶蛋白正确折叠,提高重组蛋白可溶性等功能。

此外SUMO还有一项重要的应用,就是可用于完整地切除标签蛋白,得到天然蛋白。因为SUMO蛋白水解酶(我公司可提供)能识别完整的SUMO标签蛋白序列,并能高效地把SUMO从融合蛋白上切割下来。切除SUMO后,经过亲和层析,去除标签蛋白部分,就得到和天然蛋白一样的重组蛋白。所以SUMO标签也常用于和其他标签一起应用,作为特异酶切水解位点。


蛋白标签都需要去除吗?

一般为了不影响目的蛋白的后续应用,都会选择一定的方式将表达时带上的各种标签去除。所以在设计构建载体时可以在标签蛋白和外源蛋白之间加上蛋白酶识别位点,这样表达纯化得到融合有标签的目的蛋白后通过蛋白酶切的方式将标签去除,得到完整的目的蛋白。这些常用的蛋白酶位点有:HRV 3C蛋白酶切位点、TEV蛋白酶切位点、肠激酶切位点、SUMO蛋白酶切位点等。但是也有几点需要说明:

1)这些酶切位点特异性都比较高,但切割效率各不相同;
2)除了SUMO蛋白酶之外,其它常用蛋白酶切除标签后都会残留几个氨基酸残基。SUMO蛋白酶识别的是SUMO标签的空间结构,然后将这个标签完整切除,不会留下多余的氨基酸残基;
3)蛋白酶的切割效率也受识别位点附近的氨基酸残基性质的影响,具体可以参见有关文献;
4)有些标签比较小,免疫原性也很弱,一般不用切除,也不会对后续研究和应用产生影响,可以不必切除。但是有些大的标签,如Dsb蛋白、FkpA蛋白、GST蛋白、SUMO标签等等,还是需要切除的。

蛋白标签是加在N端还是C端

N-端或C-端标记的选择还需要根据蛋白结构、定位等特性。例如对于蛋白太小容易被降解的和比较难表达的蛋白,可以利用5’端的蛋白标签。这样既能保证蛋白的稳定性,也对外源蛋白的免疫原性影响也很小,该法适用于表位筛选。如果目的蛋白是分泌蛋白,就会遇到在目的蛋白分泌到高尔基体的过程中,蛋白5’端的信号肽,会被酶切掉的问题。这样,你标签要是装在5’端,就没什么用了。

TEV蛋白酶的使用

TEV Protease(His-tag)是一种在大抽杆菌中重组表达的带His标签(6X His tag)的烟草蚀纹病毒(Tobacco Etch Virus, TEV)的半胱氨酸蛋白酶,能特异性地识别七肽序列Glu-Asn-Leu-Tyr-Phe-Gln-Gly/Ser,并在Gln和Gly/Ser氨基酸残基之间进行酶切,常用于去除融合蛋白的Glutathione S-transferase (GST)、His或者其它标签的蛋白酶。

建议把GST或His等标签设计在融合蛋白的N端,并在GST或His等标签与目的蛋白之间设计加入TEV Protease专一性识别与酶切的上述七肽序列。这样在GST或His标签被酶切后,在目的蛋白的N端仅有一个额外的Gly/Ser氨基酸残基,从而最大限度地减少了对目的蛋白结构和功能的影响。

TEV Protease的最佳酶切温度是30℃,在29-34℃范围内均具有较高的酶活性,但当温度达到或高于高37℃时,其酶活性会急剧下降。在实际操作过程中,为尽量保留目的蛋白的结构和生物活性,建议在4℃用TEV Protease酶切过夜。TEV Protease在pH6.0-9.0范围内具有活性,而当pH小于或等于5时,会失去酶活性。

TEV Protease还有一个突出的优点是在400mM咪唑中仍有较高活力,因此对于很多用镍柱纯化的His标签目的蛋白,可直接将TEV Protease加入含高浓度咪唑的刚刚纯化的目的蛋白溶液中,在4℃边透析去除咪唑边进行酶切。当然也可以在透析后再用TEV Protease进行酶切以去除His标签。经过酶切的目的蛋白,溶液中带有His标签的本TEV Protease以及切除下来的His标签,都可以通过与镍柱结合而去除。

TEV Protease的酶活性不会被常见的丝氨酸蛋白酶抑制剂(serine protease inhibtor)如PMSF、AEBSF、bestatin、pepstatin、E-64、TLCK和EDTA所抑制。但靶向半胱氨酸(Cysteine)残基的蛋白酶抑制剂如NEM或IAA等,可以显著抑制TEV Protease的酶活力,因为天然的TEV Protease含有其维持酶活力所必需的Cys151。

C端His标签后未马上终止对His标签特性会不会有影响?
His分离纯化的原理为组氨酸残基侧链与固态的镍有强烈的吸引力,可用于固定化金属螯合层析(IMAC),对重组蛋白进行分离纯化,若C端His标签后未添加终止密码子,多余的氨基酸可能会影响His标签的空间构象从而影响其挂壁效果。

发表评论

*为必填字段!