用于研究microRNA与靶基因5’非编码区相互作用的载体及其用途
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2012-04-10
2012-09-19
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Description
用于研究microRNA与靶基因5’非编码区相互作用的载体及其用途
技术领域
[0001] 本发明属于医学分子生物学领域，可用于不同类型HIiCT0RNA与靶基因5’非编码区相互作用的研究。
背景技术
[0002] MicroRNA (mi RNA)是一类内生的、长度约20_24个核苷酸的小RNA，其前体结构是具有发夹结构的约70-90个碱基大小的单链RNA，在细胞质中经过Dicer酶加工后生成。其在细胞内具有多种重要的调节作用^3]。每个miRNA可以有多个靶基因，而几个miRNAs也 可以调节同一个基因。这种复杂的调节网络既可以通过一个miRNA来调控多个基因的表达，也可以通过几个miRNAs的组合来精细调控某个基因的表达随着miRNA调控基因表达研究的逐步深入，将帮助我彳丨3理解闻等真核生物的基因组的复杂性和复杂的基因表达调控网络。
[0003] 传统观念认为，miRNAs主要通过其“种子序列”，特异性地结合到靶标mRNA的3’非翻译区（3′ UTR)抑制基因的翻译或者导致mRNA的降解。但是，在2005年，斯坦福大学医学院的研究人员发现了肝脏特有的miR-122与肝炎病毒mRNA 5′ UTR相互作用引起病毒增殖，这项研究首次发现在动物细胞中，miRNA可以和5′ UTR相互作用[4]。同年，IBM科学家建立了一个数学模型，“预言miRNAs标靶超越了 3′ UTR的局限，是大范围存在的”。
[0004]目前，市场已有专门用来检测miRNA与靶基因的结合活性，但主要集中在对3′ UTR研究的报告基因载体系统，如pmiR-RB-Report™报告基因检测系统。该报告系统包含SV40启动子驱动的报告荧光基因（hluc)，其下游构建了靶基因3′ UTR，通过对该荧光的监测，即可验证miRNA对该靶标是否有调控作用；另有一校正荧光基因（hRluc)用于监测转染效率，靶标表达效率，可作为稳定内参&9]。
[0005] 本发明主要以抑癌基因p53为例，将p53mRNA的5′ UTR序列克隆在荧光报告基因或绿色荧光蛋白（GFP)的上游，并在p53两侧添加I个酶切位点，便于将p535′ UTR替换，研究其它的基因的非编码区与miRNA的作用。
发明内容
[0006] 本发明提供研究miRNA与靶基因5′ UTR相互作用的分析系统。即可使用双荧光报告基因分析系统，酶切替换后也可使用绿色荧光蛋白的分析系统作为内参对照。
[0007] 本发明采用含有双荧光素酶报告基因（荧光素酶hluc及海肾荧光素酶hRluc)的质粒pLuc，经过酶切、纯化、重叠PCR扩增、连接、转化，将p53-5′ UTR序列克隆到pLuc质粒hluc区域ORF的上游，并在p53-5′ UTR的PCR引物两侧设计两个酶切位点，将其质粒命名为pLuc-p53-5′ UTR。同时，为了适应不同的需要，PCR扩增绿色荧光蛋白序列，双酶切pLuc-p53-5′ UTR质粒的Rluc区，将绿色荧光蛋白序列替换Rluc区域，将其质粒命名pGFP-p53-5′ UTR，该质粒载体进行细胞活体研究。同时，采取同样的方式，我们还可以得到pYFP-p53-5/ UTR或者pCFP-p53-5′ UTR的报告基因分析系统，扩大了研究的范围。
[0008] 本发明主要涉及miRNA靶标的研究。设计围绕研究miRNA与靶基因的5′ UTR相互作用。因为P53-5′ UTR区两侧有酶切位点，可以进行酶切替换，增加miRNA靶标研究的广泛性及灵活性。
[0009] 附图表说明
[0010] 图1PLUC-P53-5′ UTR质粒图谱构建示意图
[0011] 图2p53-5′ UTR的PCR扩增结果图
[0012] Mr IOObp DNA ladder
[0013] I.无模板的阴性对照
[0014] 2. p53-5′ UTR 的 PCR 产物
[0015] 图3pLuc质粒上HindIII和SpeI之间的序列PCR扩增结果图
[0016] Mr IOObp DNA ladder
[0017] I. pLuc质粒上HindIII和SpeI之间的序列的PCR产物
[0018] 2.无模板的阴性对照
[0019] 图4重叠PCR扩增结果图
[0020] Mr IOObp DNA ladder
[0021] I.无模板的阴性对照
[0022] 2.重叠PCR的PCR产物
具体实施方式
[0023] 本发明所述，包括酶切、回收、PCR扩增、连接、转化、测序等几个步骤。
[0024] 以下通过实施例来进一步阐明本申请的内容。应当理解，实施例仅用于示例性说明申请的技术方案的具体实施方式，而不是以任何方式限定本申请的范围。
[0025]实施例 1PLUC-P53-5′ UTR 的构建
[0026] 步骤一、SpeI酶切pLuc质粒
[0027] 酶切反应体系，如下：
[0028]
NE Buffer 4 (IOx) 5^iL BSA(IOOx) 0.5nL
pLuc 质粒 2ig
Spel 酶 IHL
总体积（双蒸水补足）50pL
[0029] 37°C孵育3小时，65°C孵育20分钟灭活该酶活性。
[0030] 酶切完毕后，酶切纯化试剂盒回收酶切片段，具体步骤，如下：
[0031] I.取50 ii L酶切反应液的体积，向其中加入100 u L Buffer DPX。
[0032] 2.将上一步所得溶液加入一个GBC吸附柱中（吸附柱放入收集管中），室温放置2分钟，12，OOOrpm(〜13，400 Xg)离心30-60秒，倒掉收集管中的废液，将GBC吸附柱放入收集管中。[0033] 3.向 GBC 吸附柱中加入 680 ii L DNAffash Buffer，12，OOOrpm(〜13，400 X g)离心30-60秒，倒掉收集管中的废液，将GBC吸附柱放入收集管中。
[0034] 4.向 GBC 吸附柱中加入 680 u L DNA Wash Buffer, 12，OOOrpm(〜13，400 Xg)离心30-60秒，倒掉收集管中的废液。
[0035] 5.将GBC吸附柱放回收集管中，12，OOOrpm(〜13，400Xg)离心I分钟，尽量除去
洗涤液。
[0036] 6.将GBC吸附柱放入一个干净的离心管中，向吸附膜中间位置悬空滴加30-50 U L去离子水，室温放置2分钟。12，OOOrpm(〜13, 400Xg)离心I分钟收集DNA溶液。
[0037] 步骤二、HindIII不完全酶切 [0038] 因为在质粒载体中有两个HindIII的酶切位点，因此此步骤采取不完全酶切体
系，如下：
[0039]
NE Buffer 4 (IOx) 5^L
BSA(IOOx) 0.5nL
pLuc 质粒 2ig
Hindlll 酶 0.5nL 总体积（双蒸水补足）50pL
[0040] 37°C孵育I小时，65°C孵育20分钟灭活该酶活性。
[0041] 酶切完毕后，酶切纯化试剂盒回收酶切片段，具体步骤，同上。
[0042] 步骤三、PCR扩增片段①，即p53_5′ UTR
[0043] 具体步骤，如下：
[0044]
PCR Buffer(IOx) 5^L
dNTP (25mM) 2iL
SiHa 细胞 cDNA l|ug
上游引物(20^M) 0.5吣
下游引物（20^M) 0.5pL
pfu 酶 0.5(_iL 总体积（双蒸水补足）50pL
[0045] 反应循环条件设置：
[0046]
[0047] 引物序列，如下：
[0048]
[0049] PCR纯化试剂盒纯化回收后，继续PCR。反应步骤及条件，同上。
[0050] 引物序列，如下：
[0051]
[0052] 步骤四、PCR扩增片段②，即pLuc质粒上HindIII和SpeI之间的序列(5345-561Ibp)
[0053] 具体步骤，如下：
[0054]
[0055] 反应循环条件设置：
[0056]
[0057] 引物序列，如下：
[0058]上游引物 LI (5′ -3′ ) AACCACTAGTCTCGTGCAGATGGAC 下游引物 L2(5, -3′ ) CCAGTCTTGAGCACATGGGAGGGCTGCAGGTCGAAAGGCC
[0059] 步骤五、重叠PCR，合成片段①+②
[0060]
[0061] 反应循环条件设置：
[0062]
[0063] 引物序列，如下：
[0064]
[0065] 步骤六、酶切PCR产物、连接、转化
[0066]
[0067] 37°C孵育I小时，65°C孵育20分钟灭活该酶活性。
[0068] 酶切完毕后，酶切纯化试剂盒回收酶切片段，具体步骤，同上。
[0069] 采用六合通公司的T4连接酶连接，具体步骤如下：
[0070]
16°C连接过夜。
[0071] 连接后产物进行大肠杆菌转化，具体步骤，如下：
[0072] I.从-80°C冰箱中取200 μ L感受态细胞悬液，室温下使其解冻，解冻后立即置冰上。
[0073] 2.加入连接产物溶液10 μ L，轻轻摇匀，冰上放置30分钟。
[0074] 3. 42°C水浴中热击90秒，热击后迅速置于冰上冷却3分钟。
[0075] 4.向管中加入800 μ L LB液体培养基（不含Amp)，混匀后37°C振荡培养I小时，使细菌恢复正常生长状态，并表达质粒编码的抗生素抗性基因（Ampr )。
[0076] 5.将上述菌液摇匀后取100 μ L涂布于含Amp的筛选平板上，正面向上放置半小时，待菌液完全被培养基吸收后倒置培养皿，37°C培养16-24小时。
[0077] 步骤七、测序
[0078] 挑取6个细菌克隆，提取质粒，送华大基因公司双向测序。
[0079] OMEGA试剂盒提取质粒,步骤如下：
[0080] I.取过夜培养的菌液I. 8ml加入到2ml EP管中，13，OOOrpm室温离心I分钟后收集细菌沉淀。倒掉上清液，再次加入菌液I. 8ml，离心后去除上清液。
[0081] 2.每管加入150 μ L Buffer A，用吸头吹打沉淀菌体至无可见细菌团块，以确保沉
淀完全散开。
[0082] 3.每管加入200 μ L Buffer B,轻轻颠倒离心管4_6次，室温放置5分钟，使细菌完全裂解，溶液应变的透明。切勿剧烈振荡，否则会导致基因组DNA断裂，从而导致所得质粒被基因组DNA污染。
[0083] 注意：加入Buffer B后,务必室温放置5分钟，以使RNase A充分发挥作用。
[0084] 4.每管加入350 μ L Buffer C，随即颠倒离心管4_6次混匀（切勿剧烈振荡），可见白色絮状物产生，室温静置I分钟。
[0085] 5.手腕用力上下振荡4-6次，使白色絮状物振散，然后置于离心机上13，OOOrpm室温尚心5分钟。
[0086] 6.将上一步骤离心后的上清倒入或吸入到质粒纯化柱内，13，OOOrpm离心30秒，倒弃收集管内液体。（切勿吸入白色沉淀，否则会堵塞离心柱）。
[0087] 7.在质粒纯化柱内加入500 μ L Washing Buffer, 13，OOOrpm室温离心30秒,洗去杂质，倒弃收集管内液体。
[0088] 8.重复步骤7—次。
[0089] 9.将吸附柱重新放入套管中，13，OOOrpm室温空离心2分钟。
[0090] 10.将质粒纯化柱置于新的I. 5ml离心管上，静置2分钟，使痕量乙醇完全挥发，力口Λ 50 μ L去离子水至管内柱面上，放置I分钟。离子水使用前50°C水浴预热。[0091] 11. 13，OOOrpm室温离心2分钟，所得液体即为质粒溶液。
[0092] 测序引物序列，如下：
[0093]
[0094]实施例 2pGFP-p53_5′ UTR 的构建
[0095] 步骤一、PCR扩增片段GFP的开放阅读框
[0096] 具体步骤，如下： [0097]
[0098] 反应循环条件设置：
[0099]
[0100] 引物序列，如下：
[0101]
[0102] 步骤二、酶切PCR产物，连接，转化
[0103] 分别酶切GFP的PCR产物及pLuc-p53_5, UTR质粒，步骤如下：
[0104]
[0105] 37°C孵育I小时，65°C孵育20分钟灭活该酶活性。
[0106] 酶切完毕后，酶切纯化试剂盒回收酶切片段，具体步骤，同上。继续酶切，如下：
[0107]
[0108] 37°C孵育I小时，65°C孵育20分钟灭活该酶活性。
[0109] 酶切完毕后，酶切纯化试剂盒回收酶切片段。将双酶切的PCR产物与PLUC-P53-5, UTR质粒进行连接，连接体系，同上。转化大肠杆菌，送华大公司测序。
[0110] 参考文献
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Claims (3)
Hide Dependent 
Claims (3)
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1.microRNA与多种靶基因的5’非编码区（5′ UTR)作用的载体设计。
2.可以使用荧光素酶检测系统。
3.可以采用绿色荧光蛋白、黄色荧光蛋白等检测系统。
Non-Patent Citations (3)
* Cited by examiner, † Cited by third party
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* Cited by examiner, † Cited by third party, ‡ Family to family citation
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