病毒包装

名词解释

293T细胞是由293细胞派生, 表达SV40大T抗原的人肾上皮细胞系, 被广泛应用于瞬时转染以过表达各种目标蛋白, 或是用以包装病毒。

脂质体：某些细胞质中的天然脂质小体，可作为生物膜，用于捕获外源性物质后更有效地运送到靶细胞，经同细胞融合而释放。

共转染的操作步骤

第一天：

用无抗生素DMEM+10%FBS铺板293T细胞，2ml/孔。确保第二天细胞密度达到80%-90%融合度。

第二天：

1）500ul 无血清培养基稀释2ug 表达质粒+1.5ug psPAX2+1.5ug pMD2.G。

2）500ul 无血清培养基稀释15ul 脂质体2000。

3）5min后，将DNA溶液和脂质体溶液混合，室温静止20min。

4）从6孔板中吸出1ml无血清培养基，然后滴加入1ml质粒和脂质体混合物。

5）6-10h后，移除含有DNA-脂质体复合物的培养基，代之以正常培养液DMED+10%FB（从此刻开始算时间） 。

第三天：

1）转染24h后，荧光显微镜下观察，转染效率应达到70%以上。

第四天：

1）转染后48和72h分别收获含病毒的上清。

2）3000 rpm 离心20min，0.45um滤膜过滤，去除细胞沉淀。

3）12000转离心浓缩细胞、分装-80°C贮存。

4）滴度测定目的基因检定，并出具检测报告。

病毒包装的原理

质粒DNA为能转录出慢病毒遗传物质（RNA），但不能翻译出慢病毒的外壳及蛋白成分的载体质粒，其同时连有目的基因和报告基因，psPAX2为能表达慢病毒外壳的质粒，其表达产物可通过粘附机制更易穿过细胞膜， pMD2.G为慢病毒的膜蛋白质粒，通过脂质体（lipofectamine）2000进行三质粒共转到靶细胞基因组中，宿主基因组在表达时，随宿主基因转录出的目的基因RNA与psPAX2、pMD2.G基因翻译出的蛋白组装为慢病毒。

在上述程序中提及的“第四天”收集病毒。在第五天再用该病毒感染靶细胞，病毒进入细胞后，其遗传物质RNA反转录出DNA，该基因再整合到靶细胞的基因组中，完成转染过程，因为质粒DNA只能转录出病毒RNA和表达目的基因却不能表达出病毒的外壳和膜蛋白成分，因此其不能像普通的病毒一样在宿主细胞能反复增殖，故对宿主细胞是无害的并且高效的将目的基因转染到靶细胞基因组中。

慢病毒感染细胞

荧光显微镜的操作流程

打开荧光器（30min内不能关闭，否则影响显微镜寿命），细胞培养板置于载物台，调节物镜和光圈，先用自然光观察视野内细胞，再关闭光，开启荧光通道，观察荧光强度，判定感染率。图片取样前可以调节曝光时间，增益值和彩色度使荧光照片最完美。

注意事项内容 ：

1）病毒浓度要适宜，太少的话细胞被感染的也少，但是病毒浓度太大，对细胞有伤害。

2）感染病毒时培养基量少，以保证病毒的浓度，在培养10h左右可根据培养基颜色加培养基。

3）在不明确细胞感染复数情况下，可进行浓度梯度感染，计算细胞感染复数。

4）在加病毒后一般24h左右可换液，48小时即可看荧光，具体时间根据细胞状态来看。

感染后细胞检测方法

荧光初步检测

若有荧光，则表示病毒感染成功，但并不能确定目的基因是否整合到细胞中，待进一步检测，荧光有强弱之分，与病毒加入的量有关。

RNA的提取及RT-PCR检测

原理：因为真核细胞DNA含有很多非编码区，真核生物的DNA转录成为RNA之后，经过剪切和拼接，去掉这些非编码区，才能形成真正的mRNA，，是否表达真核生物的基因并表达相应的蛋白，只能通过提取其mRNA并RT-PCR这条途径来测定。

病毒滴度的测定

稀释计数法：

滴度单位：TU/ml，指每毫升中含有的具有生物活性的病毒颗粒数。”TU”为”transducing units”的缩写，中文为“转导单位”，表示可以感染并进入到靶细胞中的病毒基因组数。

第一天 细胞准备

将生长状态良好的293T细胞消化计数后稀释至1×105/ml，加入96孔板，100µl/孔，为每个病毒准备10个孔。放入37℃，5%CO2培养箱中培养。

第二天 加病毒

在EP管中做10倍梯度稀释，连续10个稀释度。稀释方法如下：每种病毒准备10个1.5ml EP管，每管加入90µl培养液，往第一个管中加入10µl病毒原液，混匀后，吸取10µl加入第二个管混匀。依此类推，做十个稀释度（10~10-8）。吸取96孔板中原有的培养基，加入含稀释好的病毒液。并做好标记。

第三天 追加培养液

在每个孔再加入100µl完全培养液，利于细胞的生长。

第五天 观察结果并计算滴度

在荧光显微镜下观察结果，并数出最后两个有荧光的荧光细胞克隆数。假设为X和Y，则滴度（TU/ml）=（X+Y×10）×1000/2/X孔的病毒液的含量（µl ）。

定量PCR法：

病毒感染1天前，取6孔板接种HOS细胞。每孔细胞为5×104个。接种细胞24小时后，取两个孔的细胞用血球计数板计数，确定感染时细胞的实际数目，记为N。

弃去其他培养板中的培养基，更换为含有5μg/ml polybrene的新鲜培养基。将浓缩病毒用培养基稀释200倍，也就是取1μl病毒加入到199μl的培养基中。在3个培养孔中分别加入0.5μl，5μl和50μl的稀释病毒。感染开始后20小时，除去培养上清，换为500μl含DNaseI 的新鲜培养基。在37℃消化15分钟，这一步是要除去残余的质粒DNA。然后换为2ml正常的培养基，继续培养48小时。

用0.5ml 0.25%胰酶-EDTA溶液消化细胞，在37℃放置1分钟。用培养基吹洗下，离心收集细胞。按照DNeasy试剂盒的说明抽提基因组DNA。每个样品管中加入200μl洗脱液洗下DNA。用DNA定量试剂盒定量（Bio-Rad）。基因组DNA可以稳定保存在-20℃至少2个月。

数据分析：测得的DNA样品中整合的慢病毒载体拷贝数用基因组数加以标定，得到每基因组整合的病毒拷贝数。

滴度（integration units per ml，IU ml-1）的计算公式如下：

IU ml-1= (C ×N× D×1000)/V

其中：C = 平均每基因组整合的病毒拷贝数；N = 感染时细胞的数目（约为1×105）D = 病毒载体的稀释倍数 ；V = 加入的稀释病毒的体积数。

空斑形成单位：

空斑检测的是具有感染力的病毒粒子数量，是病毒滴度检测的金标准。空斑形成单位测定是一种测定病毒感染性比较准确的方法，将适当浓度的病毒悬液接种到生长单层细胞的培养板、玻璃平皿或扁瓶中，当病毒吸附于细胞上后，再在其上复盖一层溶化的半固体营养琼脂层，待凝固后，孵育培养。当病毒在细胞内复制增殖后，每一个感染性病毒颗粒在单层细胞中产生一个局限性的感染细胞病灶，病灶逐渐扩大，若用中性红等活性染料着色，在红色的的背景中显出没有着色的“空斑”，清楚可见。由于每个空斑由单个病毒颗粒复制形成，所以病毒悬液的滴度可以用每毫升空斑形成单位（PFU）来表示。

TCID50测定法（50%组织培养感染剂量）：

此方法也可以计算病毒滴度，其滴度值理论上为半个具有感染力的病毒粒子数量的稀释值，理论上即可换算为logTCID50=log plaque+0.67。

VP测定法（病毒颗粒）：

OD260可以检测病毒DNA和蛋白的浓度，但不能区分完整的、有感染能力的病毒和损伤的、无感染能力的病毒。这是一个可以检测全部病毒（包括存活和死亡的病毒）含量的物理实验。因此通过检测OD260可以反映并计算出病毒颗粒（VP）的浓度。但在检测OD260以前，病毒首先必须被纯化。

此外，一些病毒还有其它较为粗放的滴度检测方法，如血凝效价、OD280等。

病毒载体的应用

1、将目的基因导入细胞实现相关功能研究，特别是对难以用转染方法实现导入的细胞。

2、将目的基因导入细胞系构建稳转株，使其目的基因能稳定表达，实现相关功能、药物的研究。

3、将过表达目的基因导入细胞系，构建能生产目的蛋白的真核细胞。

4、将目的基因导入动物组织、体内获得长期表达。

5、基因治疗。

6、转基因动物。

7、基因敲除。

8、药物研究：构建表达受体蛋白的细胞系，研究药物的作用。

9、快速建立生产目的蛋白的细胞系，非常有前途的真核细胞表达方法。