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一文掌握CRISPR/Cas9系统操作方法,超详细protocol来袭!-微信文章-仪器谱

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一文掌握CRISPR/Cas9系统操作方法,超详细protocol来袭!

2019-03-07 19:54:55


CRISPR/Cas9系统操作说明

—基于lentiCRISPR v2应用指南-载体构建和建系

前言

lentiCRISPR v2载体是张锋实验室发布的一个慢病毒载体,cas9和sgRNA表达框在同一个载体上,而且Cas9的C端带有FLAG融合标签,载体包含Puromycin抗性基因,适合建系。验证sgRNA活性的时候也适合瞬转;包装成慢病毒适合常规细胞系的建系,构建非常方便。

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lentiCRISPR v2应用指南

 

网址:https://www.addgene.org/52961/

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克隆gDNA使用BsmBI位点,载体可以切出一个~1.9 kb的filler片段,便于confirm酶切成功并利于载体回收;

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BsmBI的位点是       ,酶切之后不需要CIP脱磷也不会自连!

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Cas9的COOH 端带有FLAG tag,可以WB或者Immunostaining

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EFS promoter被优化的小而强,极大提高了慢病毒包装的效率

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载体带有Puromycin抗性,可以富集转染/感染成功的细胞。

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如何设计gDNA

 

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gDNA设计方法和原则:(主要参考以下链接:https://www.addgene.org/52961/)

gRNA设计:通常情况下我们仅需要在你的目的位置附近找到PAM序列:NGG(N代表任意核苷酸),然后找到其紧邻的上游20 nt即可 (如上图)。

目的位置的选择:我们绝大部分时候的目的是完全KO一个基因,其原理是利用移码突变(CRISPR/Cas系统诱导产生indel)。所以我们一般选择距离起始密码子ATG下游200bp范围内的exon区域。另外,通常一个基因往往会转录成2个以上的isoforms,所以请选择尽量靠近5’端的公共部分,保证每个isoform都会成功移码突变。

通常情况下,为了便于下游KO mutants的鉴定,我们往往可以作如上设计:即Cas9的切割位点刚好被一个酶切位点跨过,且附近至少100 bp内酶切位点唯一。

为了减少Off-Target效应,请把设计好的Target放在括号中的网址里去做预测,尽量找到一条脱靶效应较小的来继续下游实验(http://crispr.mit.edu )。

20 nt确定之后,请按照如上图所示合成两条配对的普通oligo即可。请注意突出的粘性末端以及补加的一个转录起始位点G。

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对于lentiCRISPR v2克隆,其合成的oligo末端和pX330不同,请注意设计;

举个例子说明(克隆小白千万注意oligo的方向)

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如何克隆载体
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Backbone的酶切体系参考下方步骤(说明:不脱磷处理参考黑框,脱磷参考红框内操作)

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Oligo的退火条件也参考下方步骤(说明:如果载体不脱磷,oligo不需要磷酸化;载体脱磷参考红框内操作,oligo就需要加磷处理!!!(红色框内是FengZhang提供的protocol,设计脱磷,仅作为参考)

仅作参考

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病毒包装体系
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包装病毒使用的包装体系如下(for 100 mm dish,6x106  293T)

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转染条件:用细胞转染试剂  LipoFiterTM(超便宜且好用)(汉恒生物LipoFiterTM官方页面,  http://www.hanbio.net/cn/products/item/36

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收集48hr和72hr病毒上清,待用。

病毒包装的protocol非常多,小编只列了基本的信息。后续会出详细写慢病毒包装步骤的干货!

 

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目的细胞系的感染/转染
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转染 (2 μg  plasmid/60 mm dish,细胞密度60-80%)【v2=lentiCRISPR v2,下同】

 

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