一文掌握CRISPR/Cas9系统操作方法，超详细protocol来袭！
2019-03-07 19:54:55
CRISPR/Cas9系统操作说明
—基于lentiCRISPR v2应用指南-载体构建和建系
前言
lentiCRISPR v2载体是张锋实验室发布的一个慢病毒载体，cas9和sgRNA表达框在同一个载体上，而且Cas9的C端带有FLAG融合标签，载体包含Puromycin抗性基因，适合建系。验证sgRNA活性的时候也适合瞬转；包装成慢病毒适合常规细胞系的建系，构建非常方便。
lentiCRISPR v2应用指南
网址：https://www.addgene.org/52961/
克隆gDNA使用BsmBI位点，载体可以切出一个~1.9 kb的filler片段，便于confirm酶切成功并利于载体回收；
BsmBI的位点是 
，酶切之后不需要CIP脱磷也不会自连！
Cas9的COOH 端带有FLAG tag,可以WB或者Immunostaining
EFS promoter被优化的小而强，极大提高了慢病毒包装的效率
载体带有Puromycin抗性，可以富集转染/感染成功的细胞。
如何设计gDNA
gDNA设计方法和原则：（主要参考以下链接：https://www.addgene.org/52961/）
gRNA设计：通常情况下我们仅需要在你的目的位置附近找到PAM序列：NGG（N代表任意核苷酸），然后找到其紧邻的上游20 nt即可 （如上图）。
目的位置的选择：我们绝大部分时候的目的是完全KO一个基因，其原理是利用移码突变（CRISPR/Cas系统诱导产生indel）。所以我们一般选择距离起始密码子ATG下游200bp范围内的exon区域。另外，通常一个基因往往会转录成2个以上的isoforms，所以请选择尽量靠近5’端的公共部分，保证每个isoform都会成功移码突变。
通常情况下，为了便于下游KO mutants的鉴定，我们往往可以作如上设计：即Cas9的切割位点刚好被一个酶切位点跨过，且附近至少100 bp内酶切位点唯一。
为了减少Off-Target效应，请把设计好的Target放在括号中的网址里去做预测，尽量找到一条脱靶效应较小的来继续下游实验（http://crispr.mit.edu ）。
20 nt确定之后，请按照如上图所示合成两条配对的普通oligo即可。请注意突出的粘性末端以及补加的一个转录起始位点G。
对于lentiCRISPR v2克隆，其合成的oligo末端和pX330不同，请注意设计；
举个例子说明（克隆小白千万注意oligo的方向）
Backbone的酶切体系参考下方步骤（说明：不脱磷处理参考黑框，脱磷参考红框内操作）
Oligo的退火条件也参考下方步骤（说明：如果载体不脱磷，oligo不需要磷酸化；载体脱磷参考红框内操作，oligo就需要加磷处理！！！（红色框内是FengZhang提供的protocol，设计脱磷，仅作为参考）
收集48hr和72hr病毒上清，待用。
病毒包装的protocol非常多，小编只列了基本的信息。后续会出详细写慢病毒包装步骤的干货！
转染 （2 μg plasmid/60 mm dish，细胞密度60-80%）【v2=lentiCRISPR v2，下同】
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