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我不允许还有人不知道怎么鉴定基因敲除细胞系

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我不允许还有人不知道怎么鉴定基因敲除细胞系

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继类转录激活因子效应物核酸酶(TALEN)和锌指核酸内切酶(ZFN)之后,出现了新一代的基因编辑工具——CRISPR/Cas9系统。作为能够进行定点基因编辑的工具,CRISPR/Cas9系统迅速成为广大科研工作者的新宠。CRISPR全称是Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats(成簇的规律间隔的短回文重复序列),Cas9的全称是CRISPR-associated protein 9,大家都简称为CRISPR/Cas9系统。Jennifer Doudna等人最初从原核生物中发现一种结构能够抵御外来遗传物质的入侵,张峰最先将这个系统应用于哺乳动物细胞的基因编辑,那么这个CRISPR/Cas9的结构是怎样的?又是如何起作用的?要如何使用它实现基因敲除?

CRISPR/Cas9的作用过程主要分为两个阶段,第一阶段,捕获外源引入的序列(对于常用的CRISPR/cas9系统来说,第一阶段是sgRNA和Cas9蛋白结合);第二阶段,转录之后的crRNA会形成pre-crRNA,引导Cas9蛋白对基因组上与sgRNA相同的靶向区域进行切割,从而达到基因编辑的目的。

基因敲除的策略

使用CRISPR/cas9实现基因敲除,主要有两种策略。第一种是敲除绝大部分的外显子,将编码靶基因的功能域都敲除。对于这种敲除方式,一般敲除之后就能保证敲除的效果,不会有蛋白残留问题,但是也有一些缺点,如果靶基因过大,敲除的难度会大大增加,另外敲除的片段会游离在细胞中,可能会以NHEJ的形式随机插入到基因组的其他位置,所以会降低敲除的阳性率。

第二种是敲除个别外显子(非三倍数的碱基,比如说2个,或者4个),造成移码,进而达到敲除的目的。这种敲除方式,在DNA水平,较容易获得纯合敲除的细胞株,但是这种敲除方式,需要在合适的位置设计sgRNA,否则就会出现在DNA水平虽然造成了移码,ORF改变,但是Western Blot(WB)检测可能仍有表达。

图1. 使用CRISPR/Cas9进行基因敲除示意图(来源:赛业生物)。

另外,也有一些少见的策略,如引入Donor来实现基因敲除。通过引入HR(Homologous recombination)载体,在HR载体中引入终止密码子,使基因翻译终止;或者在HR载体引入筛选标记,将筛选标记插入至目的基因的编码区,破坏目的基因的功能等。

如何鉴定敲除细胞系是否构建成功

如上面所讲,鉴定敲除细胞系是否构建成功,需鉴定其DNA水平。片段敲除可有如下的鉴定策略(图2)。设计引物PCR扩增三个区域,分别为两个gRNA作用的区域(Region 1和 Region 2)和敲除区域(Region 3)。如果gRNA作用的区域无法扩增出条带,而完整的敲除区域扩增出比野生型小的条带,则说明该细胞系在基因组水平上已经实现了敲除。

图2. 片段敲除细胞系的鉴定策略(来源:赛业生物)。

Region 1 (WT:815 bp;  KO:无条带)

 Region 2 (WT:687 bp;  KO:无条带)

 Region 3 (WT:2222 bp; KO:~793 bp)(差别么大,少了1000bp

图3. 片段敲除细胞系的电泳鉴定结果。Region 1扩增上游sgRNA切割位点,靶位点被KO之后不能扩增出条带;Region 2扩增下游sgRNA切割位点,靶位点被KO之后不能扩增出条带;Region 3扩增包含整个KO的区域,KO后的条带小于WT的条带(来源:赛业生物)。

sgRNA敲除通常会产生数量较少的碱基插入或缺失(indel),当产生的indel数量不是3的倍数时则造成移码,进而达到敲除的目的。琼脂糖凝胶约可区分相差100bp的DNA片段,所以无法鉴定是否产生indel。需要继续对扩增的产物进行测序鉴定。将测序结果与野生型序列进行比对,如果发生非3倍数的indel,则说明该细胞系在基因组水平上已经实现了敲除。

图4. 移码敲除细胞系的鉴定策略与结果,与原始序列相比,插入了两个碱基,造成移码(来源:赛业生物)。

移码突变除了鉴定DNA水平,还可以通过WB检测确认敲除的效果。如图5所示,在敲除细胞系中无目的蛋白的表达,说明该敲除细胞系构建成功。根据赛业众多案例的成功经验,在方案设计阶段综合考虑多种因素,科学设计sgRNA,无论是移码敲除还是片段敲除均能获得理想的实验结果。

图5. Western Blot检测蛋白敲除效果检测(来源:赛业生物)。

开展敲除实验时,目的基因、细胞类型、下游实验等均会影响方案设计和最终的敲除结果。所以需要根据实际情况来设计方案。比如需要考虑目的基因是否会影响细胞存活、细胞类型对敲除效率的影响和导入方法对下游实验的影响等。如果敲除与细胞周期、增殖、代谢等相关的基因,会存在敲除致死的情况,难以获得敲除纯合细胞株;对于增殖速度慢的细胞类型,往往难以开展敲除实验,这是由于细胞增殖过慢影响细胞的DNA修复活性并降低了编辑效率。

另外将CRISPR/Cas9体系导入细胞的方式也是多种多样的,我们常用的有三种,蛋白法、质粒法、病毒法。一般我们会选用蛋白法来做,直接合成sgRNA单链,和Cas9蛋白在体外孵育形成RNP复合物,在通过电转的形式将RNP复合物导入细胞中,这样既在较短时间内获得纯合敲除的单克隆细胞株,又不会在基因组上造成外源基因的整合,省时高效。质粒法和病毒法适合用于细胞倍增较慢的细胞系,相较于蛋白法来说,病毒法会引入外源质粒序列的整合,具体如何选用敲除方式,还要根据下游的实验来综合判断。

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