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小分子php蛋白,小分子蛋白的WB条件摸索 转载

2021-03-19 04:06:47

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码龄3年

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小分子蛋白做WB有一些讲究,做了一段时间10-20KD的WB实验,有点体会,录于此备忘。并请各位老师批评指正。

WB的常规流程略。

小分子蛋白要用高浓度的分离胶,比如15%。

电泳我用恒压,电压太大会导致跑在最前面的小分子蛋白成锯齿状,70mV*30min浓缩胶,90mV*40min。另外,溴酚蓝跑到距胶底1cm以上,可分出目标蛋白即可,不必到底。

转膜我用湿转,恒流,电流太大或时间太长易转过,膜后再贴一张膜可检验,证实。感觉150mA*(30-40min)尚可。

转膜前的平衡时间短点,几分钟甚至1min就好。平衡所用的液体及转膜液成份相同,都不要加SDS,效果是天壤之别。

其它的WB相关细节(不限于小分子)还有:

脱脂奶粉封闭走个过场就行了,5-10分钟。

尽量用脱酯奶粉TBS液配一抗,自封口袋孵4度过夜,感觉比抗体孵育盒效果好,缺点是浪费抗体(但可回收啊)

二抗40分钟即可,摇不摇随便。

配分离胶时加超纯水,压气泡, 动作宜轻柔舒缓,尽量减少对分离胶的冲击,避免分离胶成分改变.

如果加样时稍稍离心,可使蛋白成分相对纯净,曝光时条带形态更好一点。

玻璃板烘箱烘烤后不能立即灌胶,如果不预冷至室温,将导致分离胶内明显气泡,这个有切身体会。另外,从冰箱内取出的凝胶试剂盒配制的胶据说也不能明显低于室温,需略等其升温,否则也易产生气泡。

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