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miRNA动物实验方法及应用案例集锦

2014-08-26 00:00

miRNA动物实验方法

简介:

miRNA作为生命科学最为热门的研究领域之一,动物实验已经成为阐明miRNA自身功能不可或缺的关键环节,也是搭建基础研究到临床应用的桥梁,其重要性正日益显现。

动物实验影响因素多,难度大,成本高。为了解决广大科研工作者面临的这些难题,锐博生物利用自身多年积累的先进技术,成功开发出国际一流品质miRNA研究工具:micrONTM miRNA agomir和micrOFFTM miRNA antagomir。本产品采用特殊化学修饰和末端标记技术,增加体内细胞的吸收作用,提高其抵抗RNA酶降解的能力;经高度脱盐处理,降低毒副作用,使其在动物实验中操作简单,且发挥稳定和高效的作用。

应用:

micrONTM miRNA agomir和micrOFFTM miRNA antagomir在miRNA功能实验中具有非常重要的作用,分别通过模拟miRNA的作用和竞争性抑制/特异性降解内源miRNA的作用而进行功能获得性(gain-of-function)和或功能缺失性(loss-of-function)研究。micrONTM miRNA agomir和micrOFFTM miRNA antagomir具有更高的稳定性,在复杂的环境中能保持更长时间的活性,同时具有更高的细胞透过率,在没有转染试剂的情况下,也可以克服细胞膜等障碍而进入靶细胞中发挥作用。micrONTM miRNA agomir和micrOFFTM miRNA antagomir可以通过局部注射或尾静脉注射等多种方式给药,可作用于局部的组织如大脑、肌肉、皮肤、眼睛、鼻腔、耳蜗、肿瘤块等,或者体内血管丰富的器官组织,可维持长达数周的效果。
经过几年的实践检验,锐博生物推出的micrONTM agomir和micrOFFTM antagomir被证明具有良好的动物实验效果,已经应用于脑,鼻窦,骨,附睾,脾脏,肝脏,心脏等各种动物模型的miRNA动物实验。这些采用miRNA agomir和antagomir的miRNA动物实验中,大多数采用局部注射给药方式或尾静脉给药方式,给药周期需依据实验内容而定。
应用实例1:各种组织及器官

Silencing of microRNAs in vivo with ‘antagomirs’.
Krützfeldt J, et al. Nature. 2005

简介:

Jan Krutzfeldt等人发现,与miRNA inhibitor相比,micrOFFTM antagomir可以有效地抑制多种组织器官中内源性miRNA表达,并且其抑制效果可以持续23天。通过对antagomir进行突变,以及交叉验证,发现antagomir具有很高的特异性,可以实现在动物体内进行miRNA loss-of-function实验。

实验方法与结果:

对6周龄C57BL/6J小鼠尾静脉注射80 mg/kg体重的antagomir-16,连续注射三天,并在最后一次注射的24小时后收集各器官组织提取RNA。
应用实例2:心脏

MicroRNA-328 contributes to adverse electrical remodeling in atrial fbrillation.
Lu Y, et al. Circulation. 2010

简介:

来自哈尔滨医科大学的研究人员使用风湿性心脏病房颤患者的心房标本及利用快速起博诱导房颤的实验犬心房标本,通过miRNA表达谱芯片及定量PCR分析,发现miR-223、miR-328及miR-664在房颤标本中表达上调而miR-101、miR-320及峭miR-449则表达下调。其中,miR-328在犬房颤标本中上调3.9倍而在人房颤标本中上调3.5倍。进一步的研究发现,利用腺病毒过表达miR-328的实验犬及miR-328转基因小鼠均表现出房颤易感增强、L型钙离子通道电流减弱及心房肌动作电位时程缩短等心颤表型,而采用micrOFFTM antagomir-328抑制miR-328的作用或敲除内源的miR-328则能逆转这些现象。该研究还揭示,miR-328在房颤中的功能可能是通过其靶标基因CACNA1C和CACNB1实现的。

实验方法与结果:

miR-328转基因小鼠或野生型小鼠连续三天尾静脉注射micrOFFTM antagomir-328 (80 mg/kg体重),再通过测心电图以检验miR-328对小鼠房颤的影响。

应用实例3:骨

A novel microRNA targeting HDAC5 regulates osteoblast differentiation in mice and contributes to primary osteoporosis in humans.
Li H, et al. J Clin Invest. 2009 

简介:

中南大学第二湘雅医院的研究人员发现,miR-2861可通过转录后水平抑制HDAC5的表达而促进小鼠成骨细胞分化。在BMP2诱导的骨形成模型中,miR-2861由ST2间质细胞表达,并促进BMP2诱导的成骨细胞生成,而抑制miR-2861则可削弱这个作用。在正常小鼠及卵巢切除小鼠模型中,利用micrOFFTM antagomir-2861抑制miR-2861的表达,可引起HDAC5的表达上调和RUNX2的表达下调,并抑制骨形成和减少骨质。人类的miR-2861是保守的,而在两例青少年患者中发现,pre-miR-2861的突变型纯合子导致的miR-2861表达受阻会引起原发性骨质疏松症,且在这两位患者的骨样品中,HDAC5和RUNX2的表达水平也有相应的上升或下降。

实验方法与结果:

6周龄的卵巢切除小鼠连续三天尾静脉注射micrOFFTM antagomir-2861(80 mg/kg体重),再在第4天、第3周及第6周收集股骨检测HDAC5蛋白表达水平及骨形成相关指标。
实验结果:
图4    Northern Blot检测显示antagomir-2861注射在长达六周的时间了抑制了小鼠体内miR-2861的表达,并且,注射了antagomir-2861的小鼠其骨质密度较对照组低。同时,Western Blot检测显示注射antagomir-2861可促进miR-2861靶标基因HDAC5蛋白水平表达上调。

应用实例4:骨

miR-214 targets ATF4 to inhibit bone formation.
Wang X, et al. Nat Med.  2013

简介:

现有研究成果已表明,miRNA在成骨细胞分化及骨形成的过成中扮演着重要的角色。来自中国航天员科研训练中心及香港浸会大学的研究人员发现,高表达miR-214的老年骨折患者,其骨形成能力较差。作者在miR-214转基因小鼠模型、卵巢切除小鼠模型及后肢去负荷小鼠模型等多个动物模型中利用micrOFFTM antagomir-214抑制miR-214的功能后,发现小鼠骨形成能力均有显著上升。作者在进一步的实验研究中发现miR-214在骨形成中的作用主要是通过调控ATF4的表达而实现的。

实验方法与结果:

1)4周龄miR-214转基因小鼠或野生型小鼠注射使用骨头靶向输送系统负载的antagomir-214(10 mg/kg体重),两周注射一次,共注射两次,并在第二次注射的两周后收集骨头进行相关指标检测。
注射负载于骨头靶向输送系统的antagomir-214(10mg/kg体重)
2)卵巢切除小鼠注射使用骨头靶向输送系统负载的antagomir-214(10 mg/kg体重),两周注射一次,共注射4次,并在最后一次注射的两周后收集骨头进行相关指标检测。

注射负载于骨头靶向输送系统的antagomir-214(10mg/kg体重)

3)6月龄的小鼠连续三天注射使用骨头靶向输送系统负载的antagomir-214(10 mg/kg体重),并在注射完成后次日进行后肢去负荷实验,1个月后收集骨头进行相关指标检测。
注射负载于骨头靶向输送系统的antagomir-214(10mg/kg体重)

实验结果:

图5    注射了antagomir-214的后肢去负荷小鼠成骨细胞面积与骨
面积比率及骨形成率均有上升。

应用实例5:鼻腔

Overexpression of miR-125b, a novel regulator of innate immunity, in eosinophilic chronic rhinosinusitis with nasal polyps.
Zhang XH, et al. Am J Respir Crit Care Med. 2011

简介:

华中科技大学同济医学院的研究者发现,相对于无鼻息肉鼻窦炎,嗜酸性粒细胞型伴鼻息肉鼻窦炎表达更多的miR-125b,且主要为鼻窦及支气管上皮细胞表达。在相关的细胞模型及小鼠模型中,作者发现miR-125b可通过其靶标基因4E-BP1调控dsRNA诱导的IFN-alpha/beta的表达。通过鼻内滴注micrOFFTM antagomir-125b,可发现鼻腔上皮细胞的4E-BP1表达上升而IFN-alpha/beta表达减弱。在嗜酸性粒细胞型伴鼻息肉鼻窦炎中,4E-BP1表达下调而IFN-beta和IRF7则表达上调,且IFN-beta的mRNA表达水平与IL-5 mRNA表达水平和鼻腔鼻窦粘膜的嗜酸性粒细胞浸润正相关。

实验方法与结果:

使用antagomir-125b对小鼠进行鼻内滴注,一次50μg(每个鼻孔25μg),每两天注射1次,共注射3次。在第1次注射的次日于小鼠鼻内注射50μg dsRNA以诱发炎症,连续注射4天,并在第5天收集样品进行基因表达分析。
实验结果:
图6    鼻内注射antagomir-125b后,鼻腔上皮细胞4E-BP1的表达增强,而由dsRNA引起的
IFN-β表达则明显减弱

应用实例6:真皮

miR-21 regulates skin wound healing by targeting multiple aspects of the healing process.
Wang T, et al. Am J Pathol. 2012

简介:

第三军医大学新桥医院的研究人员通过小鼠创伤模型发现54个在伤口修复过程中显著变化的miRNA,如miR-21。皮肤出现创伤后,miR-21表达上调,其主要的表达细胞为表皮的激活型及迁移上皮细胞和真皮层的间充质细胞。通过局部注射micrOFFTM antagomir-21抑制miR-21的功能可削弱胶原沉积及减缓伤口愈合,特别是在伤口愈合的早期引起伤品收缩上的缺陷。

实验方法与结果:

在小鼠创口附件的真皮层注射micrOFFTM antagomir-21(16 μg)后每天测量伤口面积,持续18天。

实验结果:

图7  小鼠伤口附近真皮层局部注射antagomir-21后伤口愈合缓慢

应用实例7:脊髓

Anti-apoptotic effect of microRNA-21 after contusion spinal cord injury in rats.
Hu JZ, et al. J. Neurotrauma. 2013

简介:

中南大学湘雅医院的研究人员通过microarray发现,miR-21在大鼠脊髓损伤后表达水平显著上升。通过脊髓鞘内注射,micrOFFTM antagomir-21可削弱脊髓损伤后的大鼠后肢运动机能的恢复并扩大损害范围。进一步的研究发现,ntagomir-21是通过调控FasL和PTEN的表达而影响损伤恢复的。这个研究说明,miR-21在脊髓损伤中发挥重要的功能。

实验方法与结果:

在脊髓损伤的大鼠模型中,进行靶内注射micrOFFTM antagmor-21 (1μl/h, 20nmol/mL),连续注射3天,并在开始注射的次日起测试大鼠运动能力,持续28天。
实验结果:
图8    大鼠脊髓损伤后进行antagomir-21鞘内注射。注射antagomir-21后大鼠的运动能力下降,脊髓细胞凋亡率上升,
PTEN蛋白的表达也上升。
应用实例8:乳腺

Kindlin 2 promotes breast cancer invasion via epigenetic silencing of the microRNA200 gene family.
Yu Y, et al. Int J Cancer. 2013

简介:

北京大学医学部的研究者发现,Kindlin 2通过与DNMT3A形成复合物,诱导miR-200b启动子CpG岛的高度甲基化而抑制miR-200b的表达,而miR-200b的表达抑制是Kindlin 2诱导的乳腺癌细胞侵袭和转移所必须的条件。通过尾静脉注射micrONTM agomir-200b,小鼠原位成瘤的乳腺癌生长及转移均受到明显抑制。

实验方法与结果:

用MCF7-Flag-Kindlin2细胞在小鼠乳腺脂肪垫成瘤两周后,进行micrONTM agomir-200b的尾静肪注射,每三天注射一次,持续四周,检测肿瘤块的大小及转移克隆数。
实验结果:
图9    MCF7-Flag-Kindlin 2稳转细胞株小鼠脂肪垫成瘤两周后通过尾静脉注射agomir-200b,肿瘤的生长及侵袭能力受到了
显著的抑制。

应用实例9:肝癌模型

Identifcation of miRNomes in human liver and hepatocellular carcinoma reveals miR-199a/b-3p as therapeutic target for hepatocellular carcinoma.
Hou J, et al. Cancer Cell. 2011

简介:

第二军医大学曹雪涛教授组通过对人正常肝组织、肝炎组织及肝癌组织miRNA组进行深度测序及分析发现,在正常肝中表达量位于第三位的miR-199a/b-3p在肝癌组织中异常的低表达,并且与较差的生存相关。进一步的研究发现,miR-199a/b-3p可通过抑制靶标基因PAK4的表达而抑制PAK4/Raf/MEK/ERK信号通路,并最终抑制肝癌的生长。在SMMC-LTNM人肝癌小鼠模型中,通过注射micrONTM agomir-199a/b-3p,可抑制肿瘤的生长和AFP的表达。

实验方法与结果:

利用SMMC-LTNM人肝癌小鼠模型皮下成瘤两周后,瘤内注射micrONTM agomir-199-3p,每三天注射一次,每次0 nmol,共持续两周,并在成瘤一周后每周测量肿瘤块体积及AFP值。
实验结果:
图10    SMMC-LTNM模型瘤内注射agomir-199-3p后检测miR-199-3p的表达,以及肿瘤块的大小及血清中AFP的量,可见注射
agomir-199-3p后可检测到更高水平的miR-199-3p,而且肿瘤的生长受到了抑制,AFP表达量也减少了。
应用实例10:皮下成瘤后瘤内注射

MicroRNA-375 targets AEG-1 in hepatocellular carcinoma and suppresses liver cancer cell growth in vitro and in vivo.
He XX, et al. Oncogene. 2011

简介:

华中科技大学同济医学院的研究人员发现人肝癌组织及人细胞株中miR-375均显著的低表达。在肝癌细胞中过表达miR-375可使细胞发生G1期阻滞和凋亡,以及抑制癌细胞的增殖、克隆形成以及侵袭转移能力。进一步研究发现,miR-375的靶标基因是AEG1,在肝癌组织中,miR-375与AEG-1表达呈负相关,并通过AEG-1调控肝癌细胞的表型。在小鼠模型中,通过注射micrONTM agomir-375,可明显抑制肿瘤的增殖和生长。

实验方法与结果:

利用HepG2细胞在小鼠皮下成瘤,8天后开始注射micrONTM agomir-375,每四天1次,每次1 nmol,注射的同时测量肿瘤体积,在成瘤后第36天检测肿瘤细胞增殖及相关基因表达。
实验结果:
图11     瘤内注射agomir-375后检测其靶基因的表达及癌细胞的生长和增殖。结果可见,癌细胞的生长和增殖受到了明显的抑制,
AEG-1的表达也明显的降低。

应用实例11:皮下成瘤及瘤内注射、细胞转染后原位成瘤

MiR-20a triggers metastasis of gallbladder carcinoma.
Chang Y, et al. J Hepatol. 2013

简介:

第二军医大学东方肝胆外科研究院的研究人员通过miRNA文库筛选出17个与促进胆囊癌细胞转移的miRNA。在随后的临床标本研究上发现,其中的miR-20a与胆囊癌患者的局部侵袭、远端转移及不良预后高度相关。miR-20a的这些功能,主要是通过抑制其靶标基因Smad7的表达而促进了胆囊癌细胞的上皮间质化而实现的。通过一系列体外及体内实验,发现使用micrOFFTM antagomir-20a抑制miR-20a功能,可以恢复Smad7的表达而削弱TGF-β介导的癌细胞转移。

实验方法与结果:

1)用200nM micrOFFTM antagomir-20a孵育GBC-SD细胞三天后进行皮下成瘤,成瘤21天后开始进行瘤内注射antagomir-20a,每周两次,一次5 nmol,共注射4次,并在第一次注射的两周后收集肿瘤块。
2)用200nM antagomir-20a孵育GBC-SD细胞三天后进行脾脏种植,种植5周后收集样品检测肿瘤的肝转移。
实验结果:

图12  antagomir-20a处理组的GBC-SD细胞在小鼠体内的增殖及转移能力均明显下降。

应用实例12:皮下成瘤

MicroRNA-125b suppressesed human liver cancer cell proliferation and metastasis by directly targeting oncogene LIN28B2.
Liang L, et al. Hepatology. 2010

简介:

上海交通大学医学院的研究人员通过体外实验和体内模型发现,miR-125b可通过削弱LIN28B的表达而抑制肝癌细胞的生长、迁移和侵袭。其中,过表达miR-125b的HepG2细胞和Huh7细胞在小鼠体内的生长和转移均受到抑制,而高表达miR-125b的SK-Hep-1细胞经转染micrOFFTM antagomir-125b再进行皮下种植,其增殖能力则明显强于对照组。

实验方法与结果:

SK-Hep-1细胞用micrOFFTM antagomir-125b孵育两天后,进行皮下成瘤,四周后收集瘤块检测瘤块大小。

实验结果:
图13    转染了antagomir-125b的SK-Hep-1细胞皮下种植后成瘤体积大于转染了阴
性对照的SK-Hep-1细胞

应用实例13:细胞转染后皮下成瘤

MicroRNA-503 targets FGF2 and VEGFA and inhibits tumor angiogenesis and growth.
Zhou B, et al. Cancer Lett. 2013

简介:

华中科技大学的研究者发现miR-503可通过抑制其靶标基因FGF2和VEGFA的表达而抑制肿瘤血管生成及生长。论文作者利用转染micrONTM agomir-503的方式使H22细胞在小鼠皮下成瘤后生长能力下降。此外,HIF-1α在肝癌细胞中可下调miR-503的表达。

实验方法与结果:

实验结果:

图14  转染了agomir-503的H22细胞皮下成瘤后生长受到了显著的抑制。

实验方法参考

实验方案:

通过对前期多项动物实验资料的汇总分析,锐博生物总结出以下两套经典的实验方案供研究人员参考: 
一、局部给药: 适应模型:大脑、肌肉、皮肤、眼睛、鼻腔、耳蜗、移植瘤、生殖器等局部组织
操作指导:以移植瘤为例
1)注射体积和剂量: 
注射体积20µl至50µl,常用注射体积为50µl;如果肿瘤体积较小,为了减少注射后出现反流,可选择低量注射体积。对于初次操作的人员,可以事先在建好的移植瘤模型上注射灭菌PBS或者注射用生理盐水,作为注射操作的预实验。miRNA agomir推荐剂量:每次注射1~5nmol;miRNA antagomir推荐剂量:每次注射5~20nmol。
2)注射剂的配制: 
以10nmol agomir冻干粉一管为例,离心后先加入50µl RNase free水进行稀释。如实验组为5只裸鼠,用量为1nmol/只,则取5µl分装冻存。注射时,加入225µl PBS或注射用胜利盐水进行稀释,取50µl在瘤体内进行多点注射,可注射3~4处;如果是一次性用完,可直接加入灭菌PBS或者注射用生理盐水进行稀释。
注:  miRNA agomir和antagomir由于涉及多种化学修饰,要避免反复冻融。如果分装规格较大,第一次稀释后需要进行分装,分装剂量按照实验动物的数量来确定,尽量让解冻的试剂一次用完。
3)注射时间: 
裸鼠后侧背部种植肿瘤细胞,长至5mm X 5mm大小时开始注射(一般建模时间需要两周左右,具体将根据肿瘤细胞的生长速度而定);重复注射2至4周,每三天注射一次。注射后每天测量并计算瘤体体积,绘制生长曲线。之后取肿瘤组织,进行切片染色、qPCR、WB等实验检测抑制效果。
二、系统给药 适应模型:循环系统(免疫系统)、作用于血流丰富的脏器(肝脏、心脏、肺脏、肾脏、脾脏) 
操作指导:以免疫系统疾病模型为例
1)注射体积和计量
通过尾静脉注射,每次注射体积200µl;对于初次操作的人员,可用Balb/c小鼠练习尾静脉注射操作,注射灭菌后的PBS或者注射用生理盐水。miRNA agomir推荐剂量:每次注射5~20nmol;miRNA antagomir推荐剂量:每次注射50~200nmol。
2)注射剂的配制
miRNA agomir和antagomir由于涉及多种化学修饰,要避免反复冻融。如果分装规格较大,第一次稀释后需要进行分装,分装剂量按照实验动物的数量来确定,尽量让解冻的试剂一次用完。以10nmol agomir冻干粉一管为例,离心后直接加入200µl 灭菌PBS或注射用生理盐水进行稀释。

3)注射时间
针对急性模型(作用时间小于一周),建议单次高剂量注射; 
针对慢性模型(作用时间超过一周),建议中低剂量多次给药,每周注射2~3次加强作用效果。
注:  以上数据来源于大量科研工作者的实验结果,由于miRNA本身丰度差异大,作用的部位不一,目前动物实验的miRNA agomir及antagomir注射剂量无法建立统一标准,建议科研人员根据我们的推荐剂量结合预实验的初步结果进行调整。

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