生信学习第5天-1 – 知乎

生信学习第5天-1

被时间追杀的童鞋

miRNA交互背景知识

数据库miRBase:

功能:提供miRNA的序列以及注释的查询;

提供miRNA在基因组的定位,茎环结构序列的完整信息;

操作:输入miRNA的名称;根据物种选择基因名

(该数据库仅包含验证过的靶标信息,所以会出现部分miRNA信息无的现象)

stem-loop sequence :茎环序列 (紫色部分:为成熟的miRNA序列)

点击get sequence,可以获得fast格式的序列

deep sequence,给出了2条miRNA测序的深度。一般高丰度的那条,为guidestraint,该序列为这条miRNA的序列。

miRNA靶基因预测原理:

  1. 序列互补性:(不完全互补配对)
  • miRNA 5‘端种子序列(即第2-8个碱基)与靶基因3’UTR可形成Watson-Crick配对是所有miRNA靶基因预测原理中最重要的因素。
  • 也有报道表明,miRNA除了与mRNA的3‘UTR结合,还能与5’UTR和CDS区结合发挥作用,但是目前甚少数据库使用此算法。

2. 序列保守性:

  • 若miRNA结合位点在多个物种之间具有保守性,则该位点更可能为miRNA的靶位点(如:TargetScan,miRanda)

3. 热动力学因素

  • 计算miRNA与target mRNA结合位点形成的自由能,自由能越低,其可能性越大(miRanda, RNAhybird)

4. 位点的可结合性

  • mRNA的二级结构影响其与miRNA结合形成双链结构的能力(如:PITA)

5. 结合位点的位置以及碱基分布

miRNA结合位点在基因UTR区的位置以及相应位置的碱基分布同样影响miRNA与靶基因的结合,也会影响RISC的效率(如:TargetScan)

此外,miRNA的分布与靶基因组织分布的相关性也是靶基因预测时需要考虑的重要因素(miRNA的表达具有组织特异性)

miRNA预测靶基因数据库

TargetScan:通过搜索和每条miRNA种子序列匹配的保守的8mer和7mer位点来预测靶基因。该数据库支持通过MiRNA预测靶基因,也支持通过mRNA预测相关的miRNA

miRTARbase:主要收集经实验验证的miRNA靶标,该数据库可以通过不同方面进行查询,例如miRNA,gene, disease, pathway等。

Starbase/ENCORI:综合数据库,可进行miRNA-靶标预测,RNA-RNA分析,ceRNA网络分析,RNA结合蛋白分析等。(人,小鼠,线虫)

miRNA:可以作用的分子:

mRNA,LncRNA,circRNA,pseudogene,sncRNA

miRNA预测LncRNA/miRNA预测通路

Lncbase:专门记录lncRNA与miRNA相互作用的数据库,分成实验证据支持和软件预测两部分结果

miRpathDB2.0(人+鼠):预测miRNA的靶基因(预测的+已验证的),并通过GO,KEGG预测miRNA可能参与的信号通路

miRNA调控网络构建

miRWalk:既可以通过miRNA预测靶基因,也可以通过gene预测与之结合的miRNA;支持多个miRNA或gene同时预测

miRNA实验验证方法:

间接调控关系:

确定有表型的miRNA分子——分析miRNA表达差异情况(包括细胞水平和组织水平检测;RNA用定量PCR)——制备miRNA过表达或者抑制的实验工具(定量PCR检测过表达或者沉默效率)——细胞功能表型实验——动物水平表型验证——Rescue实验

miRNA实验验证方法

直接交互关系

miRNA负向调节靶基因的表达检测——在细胞株中过表达miRNA,然后qPCR,WB检测候选靶点的表达。筛选出miRNA过表达后表达下调的候选靶点

荧光素酶报告基因实验——将候选靶基因的3′-UTR插入荧光素酶基因的3‘端,转染细胞,同时过表达miRNA。如果miRNA对靶基因的3’UTR是有结合和抑制翻译作用的,荧光素酶表达量会减少,对底物荧光对 值就会减低,这样就能获得证据证明miRNA与靶基因3‘-UTR是有结合的。

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