ImageJ实用技巧——免疫组化分析(定量分析篇) – 知乎

ImageJ实用技巧——免疫组化分析(定量分析篇)

北漂4年,沪漂ing

在临床病理诊断中, 免疫组织化学( Immunohistochemistry, IHC) 是一种很重要的技术和手段。

免疫组化标记时细胞阳性着色程度取决于抗原含量、分布密度和标记方法及其敏感性。

一般而言,抗原含量越多,分布密度越高,阳性结果显色则越强。根据阳性标记的显色程度分为:蓝色,阴性;淡黄色,弱阳性;棕黄色,中等阳性;深棕色,强阳性。

免疫组化原理图

免疫组化分析主要有两种方法,阳性着色细胞计数法和染色强度评分法。前者是在光学显微镜下,随机多个视野下计数阳性着色细胞;后者则是在下按染色强度和染色阳性范围评分,最终分数相加。

但组织样品的病理学分析仍然是耗时且主观的程序,其中人工判断染色强度来评分,直接受到视觉偏差的影响[1]。且阳性细胞计数往往不能自动化进行,导致免疫组化分析费时费力。


这篇文章会怎么利用ImageJ进行免疫组化分析,进行全面的讲解,包括两部分:

1、利用IHC Profiler插件对样本的染色情况进行自动化评分;

2、利用Trainable Weka Segmentation插件分别对阳性细胞和阴性细胞进行计数;


一、IHC Profiler-自动分析染色情况

IHC Profiler,将阳性细胞的平均灰度值(染色强度)和阳性面积百分比(染色面积)共同作为 IHC 测量指标[2],最终给出四种评分:High positive (3+), Positive (2+), Low Positive (1+) and Negative (0)。

1、插件安装

注意:Fiji和IHC Profiler会出现不兼容的情况,导致结果错误,建议在ImageJ1中安装这个插件并使用。

ImageJ1的下载链接:

https://imagej.nih.gov/ij/download.html

该插件的安装包括插件和宏的安装,下载地址:

IHC Profiler​sourceforge.net

若无法打开可以在GitHub上下载到:

https://github.com/inanezhao/ImageJ-Tutorial/blob/master/IHC_Profiler.zip

压缩包里包含下面三个文件插件文件夹、宏文件以及官方安装教程:

(1)插件安装

将IHC Profiler文件夹放在Plugins中,重启ImageJ即可安装IHC Profiler插件:

(2)宏安装(对于Fiji是必需且重要的)

Fiji安装宏的步骤和网传的版本不同,因为IHC Profiler是基于ImageJ最初的版本编写的,在FIji上使用的时候会有不兼容的情况。

首先将IHC_Profiler.txt文件放到macros文件夹中。

然后点击Plugins -> Macros -> Install,选择该txt文件(如果是ImageJ1则跳过这一步)

即可在Plugins -> Macros中找到该宏:

注意!!!每次关闭ImageJ后,再次使用IHC Profiler需要重新安装该宏。否则得出的结果是错误的。

2、插件使用

该插件的基本原理为先对染色图片进行颜色去卷积,分出蓝色的阴性区域和棕色的阳性区域,然后判断染色类型是细胞质染色还是细胞核染色,再分别进行对应的操作[2]。

插件工作流程

(1)以细胞质染色为例:

打开图片和插件(Plugins -> IHC_Profiler)

打开插件后选择细胞质染色的Mode:

颜色去卷积默认H DAB染色:

然后即可分别得到阴性区域和阳性区域,直接得出结果:

(2)以细胞核染色为例:

选择细胞核染色Mode,并不会直接得出结果,需要先设定一个阈值:

然后点击上面安装的宏(Plugins -> Macros -> IHC_Profiler),即可得到结果:


二、Trainable Weka Segmentation-自动阳性细胞计数

该插件的使用请参考这篇文章:

一般的免疫组化图片不能通过Threshold的方法进行分割,需要利用该插件,基于机器学习算法,做到阳性细胞和阴性细胞的计数。

例如统计上图中,阳性细胞和阴性细胞的数量,经过训练之后分类器可以很好的分出阳性细胞、阴性细胞以及背景(甚至可以区分出强阳性和弱阳性细胞):

点击Create result、Get Probability可以得到分割后的图像:

通过Analyze Particles可以快速得到细胞的数量,可以参考这篇文章:

三、总结

该篇文章完整讲述了怎么利用IHC Profiler进行免疫组化分析,补充了利用Trainable Weka Segmentation对阳性细胞进行自动统计。

以后对于免疫组化分析,不必再过度依赖人工,可以通过软件的自动分析得到更加直观和稳定的数据。但前提是样品的制备、染色以及拍照时要注意避免假阳性。

与此同时,在使用插件的时候要多思考,多研究,避免出现分析错误的情况。(例如,若不安装IHC Profiler的宏文件,得出的结果会完全相反)

推荐阅读介绍IHC Profiler的这篇文献[2],以更深入地了解自动免疫组化分析的原理。

四、补充

(1)插件报错问题

如果插件出现报错等不能用的情况,建议换用ImageJ1来安装这个插件,在ImageJ1中使用,而不是Fiji。

(2)共染问题

免疫组化共染不能用IHC Profiler来进行分析,这个插件现在只包含了DAB。

如果想要分析共染的荧光强度的话,比较好的方法是通过Colour Deconvolution(Image -> Color -> Colour Deconvolution)

选择H&E DAB把粉红色、棕色以及蓝色,三个通道分别分离出来(但要注意免疫组化本身并不是化学计量的)。

通道分割结果

可以参考下面这个网站:

Colour-deconvolution​blog.bham.ac.uk

参考文献:

[1].Jensen, Ellen C . Quantitative Analysis of Histological Staining and Fluorescence Using ImageJ[J]. The Anatomical Record, 2013, 296(3):378-381.

[2].Varghese F, Bukhari A B, Malhotra R, et al. IHC Profiler: An Open Source Plugin for the Quantitative Evaluation and Automated Scoring of Immunohistochemistry Images of Human Tissue Samples[J]. Plos One, 2014, 9(5):e96801.


如果对于ImageJ使用有什么问题可以私信我,或者给我发邮件:zhaoyc9@163.com

更多教程可以关注我的专栏:

希望对大家有帮助~

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