科学合理节约样品:Trizol提RNA后提取蛋白的方法_min

1. 以1mL Trizol提取RNA为例,将水相完全吸掉后,加入300 μL无水乙醇,颠倒混匀涡旋混匀30s,使中间层快状物体完全溶解,置冰上室温5 min,离心4℃ 4000 rpm(2000g) 5min(图2)

图2

2. 取出上清(0.5 mL)置新EP管中,加入3倍体积1.5 mL异丙醇(也有方法学写丙酮、甲醇、氯仿),颠倒混匀30s,置冰上10 min,离心412000 rpm 10 min 。(将有机溶液例如丙酮和乙醇加入蛋白质溶液时,和高浓度盐类似产生沉淀,这是因为它们能够降低蛋白质的溶解度。在温度为10 ℃左右时蛋白质在有机溶剂中容易变性,所以在沉淀时必须特别注意温度0 -4 ℃)离心后就能看见图1的沉淀,我是把上清分成两管加3倍体积有机溶剂沉淀蛋白质的,因为如果蛋白过多,后期可能不易于溶解。

3. 弃上清,加入1ml 0.3M盐酸胍含2.5%甘油的95%乙醇(首先,甘油可以降低体系的极性,体系的极性降低了,有助于蛋白结构稳定;第二,甘油可以降低体系的凝固点,这样利于蛋白在低温下保存,如果不加甘油的话,蛋白反复冻融数次就会失活,甚至变性),将沉淀用枪吹散,室温放置20分钟,412000 rpm 5 min,弃上清,重复两次。加入甘油的试剂尽量1个月用完。

4. 重复步骤3

5. 加入无水乙醇洗涤沉淀,静置10-20 min412000 rpm 5 min,弃上清。

6. 室温放置10 min, 使乙醇挥发掉,不要采用真空抽干,避免过度挥干,降低蛋白的溶解度,加入200-300 μL1%SDS50℃温浴使蛋白完全溶解。浓度大约是1-2 mg。如果较难溶解,可以水浴30分钟就放在超声清洗机里10 min。最后完全不溶解的蛋白可以短暂离心去除。(网上还有网友推荐使用8MUrea+2MThiourea+4%CHAPS溶解沉淀所得蛋白质。大家可以尝试。

7. 准备上样即可

官方说明书链接:https://www.thermofisher.com/document-connect/document-connect.html?url=https://as//://assets.thermofisher.com/TFS-Assets/LSG/manuals/trizol_reagent.pdf

二、常见问题

1. 得率低:样品裂解或匀浆处理不彻底。一定要充分裂解样品,注意加入Trizol后静置的时间。

2. 最后得到的蛋白质沉淀未完全溶解:蛋白过度变性不易于溶解或蛋白量大。不宜采用强有机溶剂变性,量大可分装后加入有机溶剂。

3. 电泳时条带变形:蛋白质沉淀洗涤不充分,有有机溶剂残留,可增加步骤5静置时间。

三、注意事项

1.以上各试剂的用量都是以1mLTrizol为准,Trizol体积变化,各试剂用量随之等比例变化。

2.蛋白质沉淀可保存在含0.3M盐酸胍的95%乙醇或无水乙醇中2-8℃一个月以上或-5-20℃一年以上。

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