不放过任何实验数据！教你如何充分利用单一样本：无重复RNAseq样本差异分析
2019-04-19 11:00
各位医学方的朋友，大家好。
今天的推文主要是针对RNAseq数据处理这块，现在转录组的分析非常非常普遍，在大家的课题中，都会先去做一波RNAseq，而该分析最关键的步骤就是寻找不同的组别的差异表达基因。
大家都知道，生物学实验要求至少3个生物学重复，对于有生物学重复的数据（并且一般的转录组数据都会要求生物学重复，理论上我们做转录组测序，需要的样本量每组至少为3个生物学重复），这个处理起来就很合适，可是不知道大家有没有遇到这种问题，你恰巧拿到的数据是无重复样本，真是屋漏偏遇连夜雨，就是你的数据每个类别只有一个样本，这个时候怎么办呢？是把这个样本丢掉，装作没看见？
然而，你的boss不同意怎么办呢？真的丢掉这个数据吗？当然，还是有解决办法的。这个时候，不要慌，稳住，那我们就掏出一把利剑—Gfold软件，这个软件目前认为是做没有生物学重复样本首选的软件。
链接地址：
https://zhanglab.tongji.edu.cn/softwares/GFOLD/index.html
目前的版本是1.1.4，可以看到红色框内部指出gfold软件特别适合当没有生物学重复的情况下的RNAseq的数据分析。该软件称尤其适合做无重复样本的差异分析，它对foldchange 的计算考虑到posterior distribution，即克服了pvalue评估显著性的缺点，同时也克服了 fold change 在评估低counts 数的gene时的缺点。
软件功能
主要是5大功能如下：
分别是：
① read count计数和基因排序
② read count计数
③ 无重复样本的差异表达基因的识别
④ 两组样本均含有重复样本的差异表达基因的识别
⑤ 只有一组样本含有重复的差异表达基因识别。
那我们今天主要是针对无重复样本的差异表达基因的识别，使用的便是该软件的第三个功能，也是该软件用的相对较多的功能。
软件安装
下面我们看一下这个软件，怎么安装呢？
首先需要说明一点，这个软件不支持Windows 版本，是基于linux的一个安装软件，这个时候需要你开启你的linux服务器来安装这个软件了。
STEP1:
安装gsl软件 （安装gfold之前，要保证gsl软件先安装上，否则会报错）
下载gsl，用wget：
解压该软件：
解压之后，会出现gsl -2.2文件夹
接着进入该文件夹 ，命令如下：
红色框内为gsl-2.2的路径，你需要替换成自己的就可以了，接着用make install 安装
STEP2:
安装gfold软件
解压之后如下：生成一个文件名为feeldead-gfold-1921fd6dc668的文件夹
进入该文件夹：
接着就是比较关键的步骤，需要键入这样的命令：
这个时候，虽然会出现warning ，但是没关系，就像R里面的warning一样，我们选择忽略就行了，因为已经安装好了，有可执行文件gfold了。
STEP3:
判断该软件是否安装成功 ./gfold –h
在feeldead-gfold-1921fd6dc668文件夹下，我们输入./gfold –h 查看文件时都安装成功。
出现下面这个界面，那就说明我们成功的安装了该软件。
差异比较
下面我们介绍我们的重头戏，有了软件，怎么做单个样本的差异比较呢？
首先需要做一个说明，就是输入文件需要是5列信息，分别是列依次为GeneSymbol、GeneName、Read Count、Gene exon length、RPKM。分别表示需要输入的基因的Symbol名，基因名，基因在该样本的Count数，基因的外显子长度以及RPKM值。如果我们只是计算差异分析，我们只需要保证Read Count数据的准确性，其他的两列信息可以自己随便填充数值，但是不可以省略，否则软件会报错。
准备文件：
我们需要准备两个文件，一个是control组，一个是case组别，即我们需要比较这两个组别的差异。
首先，我们新建一个文件夹test，用于存储我们的测试数据。
便会出现新的文件夹，键入ls –l的命令，如下：
接着我们进入该文件夹，便会看到我们存放的两个需要用于比对的文件，一个代表case组，一个代表control组别：
接着我们查看了每个文件的前十行，命令和结果如下：
（我们这里加了一个|column –t的参数，保证显示的效果为列对其）
求差异:
磨刀霍霍向猪羊。既然我们的万事俱备了，那就掏出命令求差异，毕竟，我等软件只为了做这件事。
这个时候，我们先找到核武器在哪？还记得不？就是那个一连串难记的文件夹（红色框框）：
接着，就是启动它，如何启动呢？
当这些出现的时候，说明gfold软件可以被使用。
学习官网资料，告诉我们，求两个样本的差异可以这样的一条命令计算：
gfold diff -s1 sample1-s2 sample2-o sample1VSsample2.diff
diff 参数代表该软件用于计算差异， -s1 代表需要输入的第一个样本， -s2代表需要输入的第二个样本， -o即output代表结果的输出文件
此刻我们替换成我们的样本，如下：
红色框框就是我们的命令行，箭头所指代表软件开始运行工作了。
运行完毕，就会提示你 Job diff is DONE：
ok，那我们查看一下test文件夹下的文件：
我们看到就出现了caseVScontrol.diff的文件。
接着我们查看一下该文件的前100行信息
主要一共7列信息，前两列没什么可说，就是gene symbol和gene name，第三列是GFOLD值，相当于log2（Fold Change），该值等于0的基因则记为非差异基因，非0的值才是差异基因，E-FDR是基于重复的Empirical FDR，因此无重复样本的经验FDR均为1。Log2fdc以及后面的RPKM列可以忽略考虑，因为最开始的exon的长度，我们是给定的是一个虚拟的数据。
所以真正的确定差异是否显著，主要是看GFOLD值，GFOLD>0,代表case组中高表达，GFOLD<0,代表case组中低表达。
筛选差异:
导入excel 筛选差异，完美收官。
你会发现，在18163个基因中，你找到了5017个差异基因，差异太多怎么办？设定一个cutoff， 比如我们设定<-0.3或者大于0.3，结果就是：
就会看到差异数目变为1273个，这个数目还是可以接受的。
Ok，今天的推文，我们分享了如何在就在liunx环境下gfold软件的安装，如何用该软件实现单个样本的差异比较，下次碰到孤独的样本，不要轻易放弃，还是可以前处理一下的。
最后，欢迎大家留言，有不正确的地方，也请大家留言指正。
END
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