预实验 先测反应时间,1-4h,加入1000 2000 4000 8000 16000每孔细胞*5复孔 25孔的细胞

预实验决定第一天铺细胞的量和反应时间

铺完细胞,一天后加入反应10ul/孔,反应一定时间,吸上清去测,原孔板加入培养基继续培养。

注意事项

1. 需客户自行准备100%还原型Alamar Blue试剂。为得到还原型Alamar Blue,需配制Alamar Blue与细胞培养基的混合溶液,Alamar Blue与细胞培养基的比值为1:10,高压灭菌15 min。(不能对浓缩的Alamar Blue高压灭菌,也不能用PBS配制溶液,因为100%还原型Alamar Blue在PBS中不稳定。)

2. 为得到最好的结果,建议实验前先摸索孵育时间和接种细胞数量。

3. 合适密度的细胞可以增加检测灵敏度。对于96 孔板,我们建议每孔接种100 微升细胞,细胞浓度范围为:贴壁细胞在100-10,000/孔,悬浮细胞在2,000-50,000/孔,并以培养基为空白对照。对于384 孔板,细胞浓度和接种量均减半。

4. 整个过程均应为无菌操作,因为微生物污染物同样可以还原检测试剂而影响实验结果。

5. 注意接种细胞浓度和加入检测试剂后孵育时间。细胞浓度过高或孵育时间过长,会导致继发性还原反应,产生无色和荧光消失。

6. 孵育时,须避光。

7. 本产品可以使用荧光或分光光度计检测,但荧光的灵敏度高,实验误差小,推荐使用荧光检测。

操作说明

一、制作标准曲线(测定最佳孵育时间和细胞数量)

1. 每孔加入100微升细胞悬液(对数生长期细胞),对细胞计数。按比例依次用培养基等比稀释成一个细胞浓度梯度,一般要做3-5个细胞浓度梯度,每个浓度建议3-6个复孔。注:设置阴性对照:细胞培养基中不加入细胞;阳性对照:100微升100%还原型Alamar Blue(不含细胞)。

2. 每孔加入10微升Alamar Blue。阳性对照孔中加入10微升无菌的超纯水。

3. 放入细胞培养箱内培养(37℃,5% CO2)一定时间。培养基的颜色由靛青蓝开始变成粉红色就可以进入下一步。

4. 推荐用荧光分光光度计检测,激发光波长在530-560 nm之间,发射光波长为590 nm。

5. 普通分光光度计在570 nm测定吸光度,参考波长600nm。也可用570/630 nm和540/600 nm替代。

6. 绘制标准曲线。以细胞数量或孵育时间为横坐标(X轴),Alamar Blue还原率为纵坐标(Y轴)。根据此标准曲线可以测定出适合的细胞数量或孵育时间(使用此标准曲线的前提是实验的条件要一致)。

二、细胞毒性和细胞增殖检测

1. 每孔加入100微升细胞悬液(对数生长期细胞),对细胞计数。建议细胞数量为104/mL,具体每孔需要的细胞数量,需根据细胞类型决定。

2. 细胞中加入待检测药物,为检测药物对细胞增殖的作用,请设置合适的对照组,包括刺激细胞和非刺激细胞。

3. 混匀,放入细胞培养箱内孵育(37℃,5% CO2)一段时间。

4. 每孔加入10微升Alamar Blue。阳性对照孔中加入10微升无菌的超纯水。

5. 放入细胞培养箱内孵育(37℃,5% CO2)4-8 h,最佳孵育时间取决于细胞类型。培养基的颜色由靛青蓝开始变成粉红色就可以进入下一步。

6. 推荐用荧光分光光度计检测,激发光波长在530-560 nm之间,发射光波长为590 nm。

7. 普通分光光度计在570nm测定吸光度,参考波长600 nm。也可用570/630 nm和540/600 nm替代。

活力计算         

                                

1.普通分光光度计检测

Alamar Blue还原率(%)=[(E600×A570)-(E570×A600)]/[(E570′×C600)-E600′×C570] ×100

E570=氧化型Alamar Blue在570 nm波长的消光系数=80586;

E600=氧化型Alamar Blue在600 nm波长的消光系数=117216;

A570=检测孔在570 nm波长的吸亮度;

A600=检测孔在600 nm波长的吸亮度;

E570′=还原型Alamar Blue在570 nm波长的消光系数=155677;

E600′=还原型Alamar Blue在600 nm波长的消光系数=14652;

C570=阴性对照孔在570 nm波长的吸亮度(培养基,Alamar Blue,无细胞);

C600=阴性对照孔在600 nm波长的吸亮度(培养基,Alamar Blue,无细胞);

如果使用570/630 nm和540/600 nm作为替代,则:

E540=氧化型Alamar Blue在540 nm波长的消光系数=47619;

E630=氧化型Alamar Blue在630 nm波长的消光系数=34798;

E540′=还原型Alamar Blue在540 nm波长的消光系数=104395;

E630′=还原型Alamar Blue在630 nm波长的消光系数=5494;

2.荧光分光光度计检测

Alamar Blue还原率(%)= (实验组F590-阴性对照组F590)/(100%还原型阳性对照F590-阴性对照组F590)×100

F590=590 nm波长荧光值

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