[0020] 实施例1:

[0021] 使用本发明的方法单克隆了奶牛乳腺上皮细胞，具体方法如下:

[0022] (I)使用胰酶对对数生长期的细胞进行消化分离，用含10%的血清培养基终止消化。移液器反复吹打混匀悬浮细胞，使细胞成为单细胞悬液。如果吹打之后，仍有较多的细胞团，这时可以利用Η)ΤΑ进行分离消化4min，使细胞间的连接打开。接下来用胰酶再一次消化，这样单细胞较多。

[0023] (2)吸取2 μ I在步骤⑴中获得的细胞悬液，置于96孔板的一个孔的中央位置，小心放置于显微镜下，将物镜调至10倍镜下，数出2 μ I细胞悬液中的细胞总数，重复3次。如果2 μ I的细胞总数低于96个，则在根据2 μ I的细胞总数进行换算后，再吸取一定量的细胞悬液加入该孔的中央位置，直至该孔内的细胞总数为96个；如果2 μ I的细胞总数大于96个，则在根据2 μ I的细胞总数进行换算后，吸取该孔内一定量的细胞悬液，并将其移至另外一个孔的中央位置，直至原孔内细胞总数为96个。如果在该孔内出现细胞团，每个细胞团都将被视为I个细胞。

[0024] (3)在确定该孔内的细胞总数为96个后，从预先加入了 19.2ml培养基的“V”型储液槽中吸取200 μ I培养基至该孔内，反复吹打混匀，然后将此悬浮细胞培养基转移至“V”型储液槽，左右轻轻摇匀，使细胞分散均匀。

[0025] (4)用排枪吸取200 μ I的悬浮培养基至96孔板中，并在每次吸取的过程中，左右轻轻摇匀，防止细胞下沉。按照上述方法接种5块96孔板。

[0026] (5)待细胞培养24h之后，观察细胞的贴壁效果。同时，用倒置显微镜观察96孔板，标记出每孔只有一个细胞的孔。每隔3天换液一次，培养至一周并观察细胞的生长情况。如果有些孔没有细胞，再进行培养一周，这时候没有克隆出现就不会有细胞克隆出现。待细胞密度汇合至60%，将分离消化细胞转移至25cm2培养瓶进行扩大培养。

点击数：0