拥有这套单细胞测序课题设计模板,就可以轻松发20分文章!

原创 Dr.Mei 吉凯基因 昨天

2015年以来,随着BD Rhapsody™、10X Genomics、Drop-seq、Micro-well、Split-seq等技术的飞速发展,单细胞测序的成本大幅度降低,大规模样本的单细胞测序已成为可能。单细胞测序很好的解决了遗传信息的异质性问题,广泛应用于癌症、免疫、胚胎分化发育、神经性疾病等研究,为疾病或遗传发育等研究提供了有利条件。

近年来关于单细胞测序的技术突飞猛进,相应的高质量文章也呈井喷式涌现。那么作为万千科研大军中的一员,怎样才能拥有一篇属于自己的单细胞测序文章呢?在公司拿到单细胞测序的数据后怎样才能组织成一篇文章呢?接下来,小编将提供一些思路供您参考。

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立题与取材

首先,我们应该明白我们的研究目的是啥?单细胞测序能解决什么实质性的问题?

立题一定要新颖,可以在谷歌学术或Pubmed上关键词搜索“scRNA-seq”及对应的研究对象,看看哪些已经被发表了,哪些领域目前还没有人做。结合自己的研究背景和前人的研究成果选择一个创新性强的、可行度高的课题。其次,我们要选择合适的材料来做实验,这主要涉及两个方面:

1. 物种的选择:尽量选择人和小鼠来做实验,其他物种就算测序结果出来了,好多细胞类型也无法标注,因此不建议用来做单细胞测序;

2. 组织样本的选择:常规的组织样本和血液样本按照Protocol取材就行,但特殊的组织样本要参考相关文献取材,并确定样本的数量以保证足够的细胞量,最好做个预实验。

测序数据分析与文章框架构建

拿到一大堆测序数据后该怎么分析呢?怎么结合自己的课题构建一篇完整的SCI文章呢?小编将近年来高分单细胞测序的文章整理了下,文章框架大致如下:

Fig1. 总的单细胞转录组图谱

1.方案流程图;

2.对照组和实验组分别作t-SNE可视化细胞分群图;

3.所有细胞总的t-SNE可视化细胞分群图,包括细胞类群注释,各群细胞数目,占比等,可以表格的形式列出,也可以用圆饼图展示;

4.实验组与对照组中各细胞群占比情况(柱形图);

5.各主要细胞群的Marker基因t-SNE可视化图;

6.各细胞群的Top基因热力图或各细胞亚群对应的Top基因热力图;

7.各细胞群的Marker基因保龄球图。

以下图片是代表性的图片,仅供参考,各图片间不具备逻辑关系。

Fig2. 目的细胞群/亚群单细胞转录组图谱

跟前面总的细胞图谱分析方式一样,不同的是这模块只分析感兴趣的或是与研究方向密切联系的细胞群,如跟某类肿瘤的发生发展有关的细胞群。这里重点分析目的细胞群的转录图谱,他有哪些细胞亚群?marker基因是啥?哪个细胞亚群直接推动了肿瘤的发生发展?等等。具体分析方式参考Fig1.中的总单细胞转录组图谱。

Fig3. 疾病发生发展过程中基因表达模式分析

这个模块需要解决如下科学问题:

1.疾病发生发展过程中细胞分化进程(拟时序分析);

2.疾病进展过程中相关的基因表达模式分析;

3. 获得疾病进展过程中关键调控基因、转录因子、激活的信号通路等信息(GO、KEGG分析)。

Fig4. 目的细胞亚群与疾病发生发展的联系(功能表型)

此模块需要解决的科学问题:

1.目的细胞亚群组织特异性研究;

2.目的细胞亚群来源研究(拟时序分析);

3.目的细胞亚群在疾病发生发展过程中关键调控基因、转录因子、激活的信号通路分析;

4.目的细胞亚群通过什么机制调控疾病的发生发展(如增殖凋亡等);

5.目的细胞亚群与其他细胞亚群相互作用网络分析。

Fig5. 目的细胞亚群临床应用价值

前面Fig1-4对单细胞测序的结果做了一个整体分析,找出了与疾病发生发展有关的细胞亚群、相应的marker基因及调控机制。接下来需探究目的细胞亚群在临床上的应用价值,大致需研究这些内容:

1.利用TCGA数据库分析正常组与疾病组的目的细胞亚群的分布情况,其细胞占比是否发生改变;

2.利用TCGA数据库分析正常组与疾病组的目的细胞亚群的基因表达模式,如marker基因及相关的调控基因等;

3.TCGA数据库分析病人的五年生存期与目的细胞亚群的联系,看他们是否具有相关性;

4.探究目的细胞亚群的marker基因或者上下游基因是否能成为治疗该疾病的靶点(细胞实验或动物实验验证)。

Fig6. 目的细胞亚群临床应用机制研究

这部分需要解决的问题是目的细胞亚群在临床上改变患者的病情,具体机制是什么?这需要做下面这些研究工作:

1.TCGA数据库中病例样本基因表达模式分析,找出基因上调表达代表目的细胞亚群(A1)相对应的下调表达代表的另一类细胞亚群(A2);

2.分析A2细胞亚群与疾病的发生发展的联系(可参考Fig4中的分析内容);

3.A2细胞亚群调控疾病的机制(如T细胞的激活等)。

Fig7. 动物模型研究

大部分的研究做到前面几个就差不多了,数据拓展并整理下就能发一篇高分文章。但如果想冲击CNS,机制最好做得更完善些。这里大概可以从以下几个方面入手:

1.如果前面单细胞测序是人的结果,可以用小鼠疾病模型同步进行单细胞测序,看小鼠的单细胞测序分析结果与人的是否保持一致,比如是否具有类似的细胞亚群及marker基因,类似的目的细胞亚群是否与疾病发生发展有关等;

2.如果通过前面分析结果筛选出了药物靶点,如市面上有相应的药物可以给疾病模型小鼠喂药,看是否减轻小鼠症状。有条件的话可以再做一次单细胞测序,看目的细胞亚群的变化,基因表达模式的变化等。没条件的话检测加药前后细胞或动物样本的变化,验证靶点的准确性。

以上就是单细胞测序的大体研究思路,大家可以照着上面的模板做。上面的有的点包含不少内容,大家可以根据需要发散去做,不一定要全做。做的越细致越全面,文章的质量越高,在此祝大家多发高质量paper!

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