基础科研如何突破5分瓶颈?

科研 话题的优秀回答者

学过《三十六策》的同学皆知晓,二元变量研究是基础研究中最基本的逻辑结构,而三元变量研究则是基于二元变量研究的升级版本。

在三元变量的逻辑论证结构中,主变量一般由分子承担,其下游效应因素多为通路或分子,而上游驱动因素则是分子或药物,其论证基本原则可总结为16个字:先辨主次、再分上下、两两调控、三三回复。

然而,原则简明扼要,学员们咂摸一番后却没有太多实感,所以今天分享一篇分子-分子-通路的三元变量一组交互文章(题目见下图),结合实际案例,手把手带大家领略三元变量组合研究的风采。

题目四要素

从题目提炼出的科学假设:在【结直肠癌】疾病中,主变量【Keratin 80】通过结合交互变量【PRKDC】上调效应通路【AKT pathway】介导【肿瘤侵袭、转移】表型。

主变量:Keratin 80

因变量:交互变量:PRKDC

效应通路:AKT pathway

表型:肿瘤侵袭转移表型、EMT表型(摘要部分有提到)

表型嵌套设计(因果嵌套):EMT表型介导了侵袭和转移表型

机制:

直接机制:Keratin 80与PRKDC直接作用(蛋白-蛋白交互模型)

间接机制:Keratin 80调控PRKDC;Keratin 80调控AKT pathway

数据解构

本文是一篇2018年发表在Cell Death & Disease上IF=5.959的蛋白-蛋白-通路三元变量一组交互设计模式的文章,文章主要包括生物信息学、细胞、组织三个维度,文章论证内容主要包括以下几个部分:

1、单变量表型论证

2、调控关系论证:主变量调控效应变量

3、主变量和交互变量的直接作用机制论证

4、调控关系论证:主变量调控交互变量

具体内容如下:

1、单变量表型论证

1)主变量的筛选:通过生物信息数据库-TCGA数据库、Oncomine数据库对Keratin家族进行筛选,发现主变量Keratin 80在CRC中高表达(Fig1);

2)表达差异:检测40对配对的CRC样本中主变量Keratin 80在癌组织和癌旁组织的mRNA表达情况,发现Keratin 80在CRC组织中高表达(Fig2A)(临床样本);

接着检测了癌和癌旁组织中主变量的蛋白表达情况(WB、IHC)以及临床样本生存分析,发现主变量具促癌的作用(Fig2B、C);

临床数据的展示方式:三表一图(table1-3,Fig2D、E)。

3)主变量调控侵袭、转移表型论证(细胞实验):首先检测了主变量在不同类型的CRC细胞中mRNA(Fig3A)和蛋白(Fig3D)表达情况,选择主变量高表达的两株细胞Caco-2和SW620细胞进行主变量敲减操作,选择主变量低表达的细胞株RKO做过表达操作(Fig3B、C、E)。

通过transwell实验观察双向操作主变量对于肿瘤侵袭和转移表型的调控情况;(Fig3F、G)

4)主变量调控EMT表型论证(细胞实验):免疫荧光染色(Fig4A)、细胞形态观察、EMT标志物检测(Fig4C)说明主变量可以调控EMT表型。

单变量论证部分总结:依照“表达差异、正反回复、细胞动物”的口诀,作者在这部分论证中缺少了单变量回复论证以及表型的体内(动物模型)论证的设计。

2、调控关系论证:主变量调控效应变量

1)主变量调控效应通路:过表达主变量后磷酸化的AKT蛋白表达上调(Fig4D)

这里效应通路介导EMT表型、EMT表型调控侵袭、转移表型均为已知内容,作者没有论证;

2)回复实验:主变量调节表型依赖于效应通路:过表达主变量同时加入AKT通路的抑制剂,观察EMT表型、观察侵袭转移表型(正正反)(Fig5)

作者通过回复实验建立了主变量、效应通路、EMT表型、侵袭、转移表型之间的连接,不足之处是:作者没有设计主变量经由嵌套表型来调控结局表型的回复实验。

3、主变量和交互变量的直接作用机制论证

作者通过内源性co-IP实验证明了主变量可以拉交互变量以及交互变量可以拉主变量(Fig6A),接着通过免疫荧光染色展示了主变量和交互变量在核膜处存在着共定位的情况(Fig6B)。

在直接机制这部分的论证中,交互变量的选取是通过co-IP+质谱鉴定的方式,选取的交互变量PRKDC是和效应通路AKT pathway具有已知调控关系的明星分子。

蛋白-蛋白交互直接作用,作者没有先通过外源性co-IP验证,而是直接做了内源性co-IP,虽然设计了双向互拉、亚细胞共定位,但是没有进一步进行分子分段来验证结合位点、位点突变、以及位点突变后的调控关系和功能验证,导致直接交互论证环节存在着很大的论证缺憾。

4、调控关系论证:主变量调控交互变量

1)通过WB结果展示了主变量对于交互变量的正向调控关系(Fig7A)

2)主变量调控效应通路、嵌套表型、结局表型依赖于交互变量的回复实验设计:过表达主变量同时抑制交互变量观察效应通路、嵌套表型、结局表型(正正反)(Fig7)

文章论证逻辑

1、Keratin 80主变量筛选及单变量表型论证(Fig1-3、Fig4A-C)

2、调控关系论证:Keratin 80调控AKT pathway及回复实验(Fig4D、Fig5)

3、调控关系论证:Keratin 80调控PRKDC及回复实验(Fig7)

4、蛋白-蛋白直接作用机制论证:Keratin 80结合PRKDC(Fig6)

(点击看大图)

文章套路及短板总结

1、本文是一篇三元变量一组交互+表型嵌套模式的文章,主变量和交互变量为蛋白-蛋白直接作用,交互变量下游调控的效应变量是一个通路介导表型的间接机制论证。

表型方面,作者设计了因果嵌套的模式,进一步增加了文章的层次,值得借鉴。三个变量+两个表型,文章整体框架显得很丰满。

2、变量选择方面:通过生信数据库预测筛选了主变量,通过co-IP+质谱鉴定的方法筛选了交互变量。

除了主变量承担文章的创新外,交互变量和效应变量以及表型之间调控的关系都是已知的,论证逻辑清晰。

但是在主变量的单变量表型论证方面,作者缺少了单变量回复论证以及表型的体内论证的设计。

3、调控关系方面:调控关系围绕主变量展开,主变量调控交互变量及回复设计,主变量调控效应变量及回复设计,作者都有论证。

但是在主变量介导表型嵌套的论证上,缺少了回复实验的设计,没能进一步突出主变量经由嵌套表型介导结局表型的因果嵌套的逻辑关系。

4、蛋白-蛋白直接作用方面:作者只进行了最基本的论证——内源性co-IP互拉+亚细胞共定位,没有进一步做作用位点验证、位点突变结合论证、以及突变后调控关系和表型论证。

交互模块论证的三个层次,作者只论证了第一层次,这也是本文最突出的短板,也决定了文章的档次只能在5分多一点的水平。

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