亲自尝试了,效果ok。
蛋白溶解特别慢,特别慢,要有耐心。

具体的提取步骤如下:
1.
样品加氯仿分层后,移去上层水相(该水相里就是RNA,可照常继续进行RNA的提取),加0.3ml乙醇沉淀中间层和有机相中的DNA,涡旋混合,室温放置3分钟,2-8℃不超过2000×g离心5分钟。【注:这一步同时可以除去未完全消化的残渣】
2.
小心吸出沉淀后的上清,加1.5ml异丙醇沉淀蛋白质。室温放置10分钟,2-8℃12000×g离心10分钟弃上清。
3.
加2ml含0.3M盐酸胍的95%乙醇洗涤蛋白质沉淀。室温放置20分钟,2-8℃7500×g离心5分钟,弃上清,重复两次。【注:不太清楚为什么这个时候用这么强烈的变性剂?防止蛋白降解?】
4.
用2ml无水乙醇同样方法再洗一次。
5.
真空抽干蛋白质沉淀5-10分钟,用1%SDS溶解蛋白质,反复吸打,50℃温浴使其完全溶解,不溶物2-8℃10000×g离心10分钟除去。分离得到的蛋白质样品可用于Western Blot或-5至-20℃保存备用。【注:无水乙醇很容易挥发,所以几分钟就能抽干;没有真空抽干机也无所谓,把无水乙醇倒掉,开盖子静置几分钟就行了。这一步干燥千万不能太干了,否则溶解的时候很不爽——很难溶解.我是在50度水浴中过夜,或者每水浴30分钟就放在超声清洗机里清洗10分钟——虽然不是专门用来粉碎细胞的超声,但毕竟是超声波哦,还是蛮有效果的。:D】
注意事项:
1.以上各试剂的用量都是以1mLTrizol为准,Trizol体积变化,各试剂用量随之等比例变化。
2.蛋白质沉淀可保存在含0.3M盐酸胍的95%乙醇或无水乙醇中2-8℃一个月以上或-5至-20℃一年以上。
3.这一步可省去:用0.1% SDS在2-8℃透析三次,10000×g离心10分钟取上清即可用于Western Blot。

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