免疫荧光法常规流程

封闭液还可以,以后可以都使用这种配方的封闭液。

一抗稀释液也可以,CST还是挺靠谱的。

A. 溶液和试剂

若想获得高质量的免疫荧光图片,请使用我们 #12727 Immunofluorescence Application Solutions Kit 中高效且划算的预制试剂。

:利用反渗透去离子水 (RODI) 或同等级别的水制备溶液。

  1. 20 X 磷酸盐缓冲液 (PBS):( #9808) 为了制备 1 L 1 X PBS:添加 50 ml 20 X PBS 至 950 ml dH2O,然后将其混匀。注:调节 pH 至 8.0。

  2. 甲醛:16%, 无甲醇,Polysciences 公司出品。(货号 18814),使用新鲜制剂,小瓶打开后避光 4°C 保存。按照 1 比 4 的比例在 1X PBS 中稀释,制成 4% 甲醛溶液。

  3. 封闭缓冲液:(1X PBS/5% 正常血清/0.3% Triton ™ X-100):准备 10 ml 缓冲液,添加 0.5 ml 与二抗同一物种来源的正常血清(例如加入 Normal Goat Serum (#5425) 到 9.5 ml 1X PBS 中)并混匀。搅拌时加入 30 µl Triton™ X-100。

  4. 抗体稀释缓冲液:(1X PBS/1% BSA/0.3% Triton™ X-100):准备 10 ml 溶液,添加 30 µl Triton™ X-100 到 10 ml 1X PBS 中。混匀后再加入 0.1g BSA (#9998),并混匀。

  5. 荧光物质标记二抗:(抗小鼠 #4408, #4409, #8890, #4410) (抗兔 #4412, #4413, #8889, #4414)(抗大鼠 #4416, #4417, #4418)。

  6. Prolong® Gold Antifade Reagent (#9071), Prolong® Gold Antifade Reagent with DAPI (#8961)。

B. 标本准备

I. 培养细胞系 (IF-IC)

:细胞应当在多孔板、腔室玻片或盖玻片上直接培养、处理、固定和染色。

  1. 吸干液体,随后在细胞上覆盖一层 2–3 mm 用温热 PBS 稀释的 4% 甲醛。

    :甲醛有毒性,仅限通风橱中使用。

  2. 室温下固定细胞 15 分钟。

  3. 吸干固定液,用 1X PBS 漂洗三次,每次 5 分钟。

  4. 继续进行免疫染色操作(C 部分)。

II. 冰冻/低温切片 (IF-F)

  1. 冰冻固定组织进行免疫染色(C 部分)。

  2. 对新鲜未固定的冰冻组织,立刻按下列步骤固定:

    1. 将切片覆盖一层用温热 1X PBS 稀释的 4% 甲醛溶液。

    2. 室温下固定切片 15 分钟。

    3. 用 PBS 漂洗玻片三次,每次 5 分钟。

    4. 继续进行免疫染色操作(C 部分)。

C. 免疫染色

:所有随后的孵育都应当在室温下完成,除非另外注明需要在潮湿光密盒或带盖的培养皿/板中孵育,以防止干燥和荧光物质淬灭。

  1. 在封闭缓冲液中封闭标本 60 分钟。

  2. 封闭标本时,按照数据表中推荐的稀释比例,在抗体稀释缓冲液中配制一抗。

  3. 吸去封闭缓冲液,加入稀释后的一抗。

  4. 4°C 孵育过夜。

  5. 用 1X PBS 漂洗三次,每次 5 分钟。

    :如果使用荧光物质标记的一抗,则跳转到 C部分,第 8 步。

  6. 用抗体稀释缓冲液将荧光物质标记的二抗稀释后,室温下避光孵育标本 1–2 小时。

  7. 用 1X PBS 漂洗三次,每次 5 分钟。

  8. 使用 Prolong® Gold Antifade Reagent (#9071) 或 Prolong® Gold Antifade Reagent with DAPI (#8961) ,用盖玻片盖住切片。

  9. 要达到最佳效果,使用封片液室温过夜。将切片平放避光 4°C 环境下,可长期保存。

发布于 2006 年 11 月 

修订于 2016 年 7 月

点击数:0