在293 细胞中大量扩增腺病毒 – 实验方法 – 丁香通

在293 细胞中大量扩增腺病毒

一旦重组病毒已被纯化和鉴定,即可在293 细胞中进行大量扩增。本手册提供了递增培养规模和腺病毒感染周期的基本方法,按这一方法最终得到的病毒量约为3×1011~3×1012。由于一个细胞中所含的病毒颗粒为1000~10000,因此1L 培养细胞可得到约5×1012 病毒颗粒。如果要把病毒用氯化铯梯度离心纯化,则必须至少3×108 的细胞,这样才能正确分辨出病毒带。

对于蛋白表达,则根据需要可在任何一步扩增步骤中停止,离心沉淀细胞后按照适当的操作方法进行蛋白抽提(根据蛋白类型的不同抽提上清或细胞沉淀)。为优化时间进程,每个感染周期必须与下一次细胞扩增培养同步。如果由于各种原因不能同步,则必须将病毒冻存,直至下一次细胞培养开始后再融化病毒。注意每次扩增都将会剩下一些病毒,这些病毒先不必丢弃,以便下一步扩增失败时备用。每次扩增最好都用最低代的病毒颗粒,这样产生突变型病毒的可能性会大大降低。

操作步骤:

1 在100mm 培养皿或75cm2 培养瓶中加入10ml DMEM5%培养5×106 293 细胞。

2 取0.5ul 首次扩增的病毒保存液,加入DMEM5%至1ml,混匀,这样稀释得到的MOI 值约为5。

3 移去培养液,小心加入病毒混合液,切勿破坏细胞单层,十字形慢慢晃动3 次,37℃ CO2 孵箱中培养90 分钟。

4 加入9ml DMEM5%。

5 再培养72 小时,这时在10ml 溶液中大约有5×109~5×1010 个病毒颗粒,进行MOI 测定以估计病毒颗粒。

注:如果此时得到的病毒量已足够,可立即进行病毒滴度测定。收集细胞,600×g 离心5 分钟沉淀细胞,去上清后加入最小体积(一般为原始体积的1/10 即1ml)病毒保存溶液重悬细胞。-200C /370C 冻融3 次,台式离心机上以最大速率离心去除细胞碎片,收集上清,然后进行病毒滴定。

6 -20℃/37℃冻融3 次。

7 转入15ml 无菌离心管中,台式离心机上以最大速率离心10 分钟,收集上清冻存于-20 ℃或-80 ℃。

8 3 个175cm2 培养瓶中各加入107 293 细胞进行培养。

9 将3ml 细胞裂解液上清加入12ml DMEM5%中,混匀。移去细胞培养液,每瓶小心加入5ml 混合液,十字形慢慢晃动混匀3 次,370C 5%CO2 孵箱中培养90 分钟。此时MOI 值约为25。

10 加入DMEM5%至30ml。

11 再培养48~72 小时。此时10ml 培养液病毒量约为3×1010~3×1011。若需要,进行MOI 测定以估计病毒滴度。

注:如果此时病毒量已可以满足实验所需,则可立即进入病毒滴定步骤。600×g 离心5 分钟收集细胞,弃上清,加入1/10 原始体积的溶液重悬细胞。-200C /370C 冻融3 次,台式离心机上以最大速率沉淀细胞碎片,收集上清,进行病毒滴定。

12. 移入50ml 离心管中,台式离心机上最大速率离心10 分钟,取出上清保存。

13. 30 瓶175 cm2 培养瓶中每瓶各加入107 293 细胞。

14. 将45ml 细胞裂解液上清加入105ml DMEM5%混匀,从培养瓶中移去培养液,加入5ml 混合液感染细胞,十字形缓慢晃动3 次混匀,370C 培养90 分钟。此时MOI 值约为25。

15. 加入DMEM5%至30ml/瓶。

16. 再培养48-72 小时,此时约有3×1011~3×1012个病毒。若需要,进行MOI 测定估计病毒滴度。

如果要收集病毒颗粒,先收集被感染细胞,然后重悬在5ml DMEM5%中。-200C /370C 冻融3 次,离心沉淀细胞碎片。此时5ml DMEM5%中3×1011~3×1012 个病毒颗粒,浓度为6×1010~6×1011vp/ml。然后测定病毒滴度,或者用标准的氯化铯密度梯度离心法纯化病毒。

在109 细胞中扩增病毒可获得大量病毒保存液,而在1010 细胞中扩增则有一定技术性。切勿将扩增后的病毒保存液再用来感染细胞,因这会大大增加RCA 产生量。有时不得不使用纯化空斑以最大可能降低RCA 产量。如果已没有纯化的空斑,那么就不得不重新空斑纯化重组病毒,鉴定克隆后再进行扩增。

如果需要大于扩增4 轮后的病毒量,注意请用早期的病毒作为扩增源。比如,用第2 代病毒产生第3 代病毒。如果没有第2 代病毒,那么必须用第1 代病毒来产生新的第2 代病毒。按这个原则进行扩增可使RCA 水平尽可能低。

如果用于表达蛋白,则可以收集细胞后根据蛋白特点选择适当方法抽提蛋白。细胞沉淀中一般可提取1-5mg 蛋白,建议在小规模扩增后先测定感染后抽提蛋白的最佳时间,然后再大量扩增蛋白。

腺病毒扩增

第一代 第二代 第三代 第四代
每瓶细胞数 1×105 5×106 1×107 1×107
培养瓶大小(cm2) 75 175 175
培养瓶数 24 孔板1 孔 1 3 30
首次扩增后的病
感染来源 稀释的空斑 第二代病毒 第三代病毒<>
毒保存液
0.5 mL 或
每瓶接种量 0.1 mL 1 mL 1 mL 1.5 mL
2.5×107
总培养体积 1 mL 10 mL 90 mL 900 mL
MOI 0.01 5 25 25
滴度(VP/mL) 1×108·9 5×108·9 3.3×108·9 3.3×108·9
总病毒量 1×108·9 5×109·10 3×1010·11 3×1011·12

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腺病毒常见问题与解答_蛋白质组学_新浪博客

腺病毒常见问题与解答_蛋白质组学_新浪博客

1、腺病毒载体对目的基因的长度是否有要求?

有要求。对E1和E3双缺失的腺病毒载体,比如AdMax的Kit C、Kit D等,其总包装的外源片断要求小于8 kb。而对于只有E1缺失或E3缺失的载体,比如Kit A、Kit B等,外源片断要求小于5 kb。注意,外源片断指包括启动子、外源基因和poly A等在内的整个插入片断。

2、我的试验需要多少总量的腺病毒载体?

腺病毒介导外源基因的基因治疗研究一般分为体外培养细胞试验(体外试验)和动物试验(体内试验)两部分,不同的实验设计所需要的病毒量也不尽相同。根据经验,完成一个完整的肿瘤治疗实验需要腺病毒的病毒量总量约为3×1012 VP左右.

3、如何提高腺病毒的活性?

提高腺病毒的活性,关键应该是在病毒包装过程和扩增过程。纯化过程只是去掉有缺陷的病毒和细胞碎片等容易引起机体免疫反应的过程,如果扩增的病毒滴度高,那么纯化后就会更高的。

4、克隆到转移载体的基因中的5’和3’UTR(未翻译区)的额外的碱基会影响蛋白表达吗?

UTR尽可能短一些,特别是在5’要避免在mRNA里形成二级结构。在起始密码子ATG前面可以加一小段(6-9bp)的碱基序列可以增强目的基因的表达,比如Kozak序列(GCCGCCACCATG)。

5、如何判断腺病毒载体是否能高效感染某种细胞?

参照文献报道是最简单的办法,也可以用带报告基因的腺病毒先行预实验。

Ad5能高效感染绝大多数人类、小鼠等的体细胞(包括分裂和非分裂细胞),比如肝、肌肉、神经组织等。但对血液系统来源细胞和某些肿瘤细胞,比如乳腺癌、白血病细胞等,感染效率较低。

6、腺病毒载体在体外实验(in vitro)中应注意哪些问题?

1)由于细胞表面受体的差异,腺病毒载体在不同的细胞中转导效率不同。可根据文献报道或用带报告基因的腺病毒载体判断病毒用量。

2)在细胞处于对数生长期时感染病毒效果较好。避免在消化细胞后立刻感染病毒,因为此时细胞膜上的病毒受体往往受到了暂时的破坏。培养过夜后再感染病毒,效果较好。

3)选择适当的转导MOI(病毒感染单位数/细胞数),可以在MOI为
0.1~1000范围内进行试验( 10倍比稀释)。

4)感染病毒时细胞培养液的体积尽量小一些,以完全覆盖细胞为准。如24孔板可用200ul,6孔板1ml。

5)感染时间为90分钟,每15分钟轻轻晃动培养液一次,以混匀。

6)选择适当表达检测时间,一般感染病毒24h后就能检测到目的基因的表达,
48小时表达达到较高水平。

7、用于体内试验的腺病毒,是否要求纯化?

是的,病毒纯化是很必要的。因为细胞裂解液包含有缺损颗粒、大量的腺病毒fiber和penton蛋白(细胞毒素)、培养基、血清以及细胞碎片。这些杂质如果被注入动物体内,会引起宿主强烈的免疫反应。另外,纯化的作用还包括可以将病毒浓缩至一定浓度便于注射、使病毒悬浮于适于体内注射的缓冲液中等。

8、如果我的实验中需要将重组腺病毒注射入动物体内,如果贵公司提供的纯化产品比较浓,需要如何稀释病毒产品,有特殊要求吗?

在实验过程中稀释病毒产品的等渗溶液没有其他特殊要求,常规的动物试验用等渗溶液即可,如PBS、生理盐水等。稀释后的样品尽量一次用完,在没有保护剂的情况下,腺病毒在2~8℃保存时间越短越好。

9、小鼠体内注射腺病毒,一只小鼠肌注大概多少量?体内表达时间和表达高峰如何?

大部分文献显示,腺病毒用量范围在108-10IU/只小鼠。根据经验,小鼠肌注腺病毒后,3~4天目的蛋白的表达达到高峰,一周后逐渐下降,持续表达时间在两周左右。

10、腺病毒载体对小鼠的半致死剂量(LD50)大概是多少?

根据经验,静脉注射小鼠(昆明鼠),半致死剂量LD50大约为1×1011v.p./只;裸鼠和SCID鼠可能更敏感一些。肌注方式的LD50未测到:1×1012v.p./只给药,未发现小鼠死亡。

11、什么是RCA,怎样才避免?

在扩增或制备复制缺陷型腺病毒时会产生复制型腺病毒(replication competent adenoviruses,RCA),RCA是因为重组腺病毒的基因组与293基因组的E1同源序列间发生重组而产生的。这就导致目的基因丢失而被E1区代替。具体表现是在本不支持病毒载体复制的细胞株(如A549细胞)上产生病毒的复制和扩增。实验证明,复制型腺病毒(RCA)
数量随着腺病毒载体在293细胞上的传代次数的增加而增加。RCA在其宿主细胞中可以自主复制和扩增,因此RCA的产生会严重干扰重组腺病毒载体的使用效果和带来安全隐患。要避免RCA出现,以下两点非常必要:

1)对原始毒种进行1~3轮空斑纯化;

2)尽量减少腺病毒在293细胞上的传代次数,建议建立至少两级病毒种子库。

一旦毒种中发现了RCA,理论上可以采用多轮空斑筛选的方法去除RCA。但根据经验,这种方法往往费时费力,且效果不好。如果条件允许,建议重新重组出毒。

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