衰老让我得了骨关节炎?不能的!我有YAP-TEAD-FOXD1逍遥丸!

2020-02-16 16:23
来源:医学课题实验服务

  • Tags: YAP TEAD FOXD1 MSC

基因修护,重塑年轻!

衰老可以导致许多慢性疾病的发生,骨关节炎是其中一种。小编上次跟部门的小伙伴分享了这篇文章,仙女们的反馈十分积极,说要往医美事业部打电话,让他们研发个能持续分泌YAP-FOXD1的细胞系收它的上清,敷面膜!

下面就跟着小编一起来看下这篇文章的研究内容吧,如觉得写得好,欢迎关注、评论和转发,爱你们!O(∩_∩)O哈哈~

文章题目

文章发表于:《PLOS BIOLOGY》 2019年4月1日 IF:9.163

文章思路

图1

研究背景

间充质干细胞(MSC)具有自我更新和分化成多种细胞谱系的能力,如软骨细胞、成骨细胞和脂肪细胞,参与组织修复和体内平衡维持。间充质干细胞的衰老可以导致器官衰竭和老年退化性疾病的发生,而骨关节炎是一种普遍的年龄相关性疾病。体外培养的间充质干细胞移植到骨关节炎关节中已被证明可以改善症状,但关于缓解内源性MSC衰老,从而用于骨关节炎的治疗目前还没有报道。Yap、TAZ是hippo通路的主要靶点,在调控发育、稳态、再生等方面发挥重要作用,同时YAP的失调可以导致细胞无限增殖从而诱发肿瘤,被认为是“癌基因”的一种。

正文

第一步:利用改良的CRISPR/Cas9基因编辑技术获得YAP、TAZ特异性敲除的人类胚胎干细胞

通常情况下,敲除几个碱基可以使目的基因失去功能,但可能会导致新的异常蛋白产生,从而引入不可排除的因素。为了避免这点,研究者改良了CRISPR/Cas9基因编辑技术,对YAP、TAZ基因组进行了完全敲除,获得YAP、TAZ特异性敲除的人类胚胎干细胞。

第二步:发现YAP与MSC细胞衰老密切相关

通过定向分化技术将人类胚胎干细胞诱导为间充质干细胞(MSC)。

发现失去YAP基因的MSC相比于正常,或者失去TAZ基因的MSC细胞表现出了明显的衰老表型,随后将敲除YAP后的hMSC注射到免疫缺陷小鼠胫骨前肌验证了衰老的发生。同时,作者在野生型(WT) hMSC中通过慢病毒特异性敲低或者过表达YAP基因,也验证了YAP基因与hMSC衰老有密切关系,敲低或过表达TAZ基因则无类似现象。

图2

第三步:发现YAP-TEAD信号轴与MSC细胞衰老密切相关

研究者接下来对YAP和TAZ进行了亚细胞定位,发现在hMSCs中,YAP主要位于细胞核中,而TAZ主要位于细胞质中。而核转录因子TEAD家族已被证明可以与YAP结合调控细胞。为了验证YAP是否与TEAD共同作用调控hMSC衰老,研究者阻断了(敲低KD/敲除KO)TEAD家族所有成员在hMSCs中的活性。与YAP-/-的hMSC相似,TEADs KD / KO hMSCs也显示出过早衰老的主要表型,例如SA-β-gal阳性细胞明显升高数量增加(图3C)。

图3

第四步:发现FOXD1是受YAP-TEAD转录调控的下游效应分子

作者随后进行了WT/YAP – / – /TAZ – / – 的hMSCs的RNA测序,与WT hMSC、TAZ – / – hMSCs相比,而YAP – / – hMSC显示出大量的差异表达基因:与WT组相比,YAP – / -敲除组有862个基因下调,在这862个下调基因中选取了476个(55%)作为潜在的TEAD靶标,其中发现FOXD1是YAP – / -·hMSCs中下调最多的基因(遗憾的是作者并没有在文章中附图),并通过WB证实了FOXD1是由YAP转录控制的。

随后作者检测了FOXD1启动子区域,确定了4个假定的TEAD结合位点然后使用染色质免疫沉淀(ChIP)发现YAP和TEAD4主要结合在foxd1tss上游1000 bp以内,并假设此处存在一个TEAD结合位点。接下来,研究者将该启动子区域(-1,000bp到TSS)克隆为基本Luc报告基因上游的转录元件。报告基因活性在YAP – / – hMSC中比在WT细胞中显著降低(图4K),并且在YAP或TEAD1过表达时增加。

在组成型活化的YAP突变体(YAP-S127A)的表达后,Luc活性甚至更高,并且通过YAP和TEAD4的共表达进一步增强(图4L)。当我们突变掉预测的TEAD结合位点时,高水平的Luc活性被显着消除(图4M)。并且Luc活性对细胞TAZ水平不敏感(图4K)。上述种种实表明:YAP-TEAD通路调控着FOXD1的表达。

图4

第五步:FOXD1参与YAP – / -诱导的hMSCs衰老

为了验证FOXD1是否参与YAP – / -诱导的细胞衰老,作者使用慢病毒系统分别敲除和过表达了hMSCs中的FOXD1。

发现FOXD1的敲除增加了SA-β-gal阳性细胞的百分比(图5B),而 FOXD1 在YAP – / – hMSCs过表达可有效缓解衰老的加速(图5C)。

作者还利用RNA-seq检测了FOXD1 KO hMSCs的基因表达谱,发现FOXD1 KO降低主要与细胞分裂和DNA复制相关的基因表达,许多差异表达的基因在YAP – / – (与WT相比)和FOXD1 KO(与NTC转导的相比)hMSC之间重叠,包括116个上调基因(占YAP- / – hMSC中总上调基因的20%)和276个下调基因(占YAP – / – hMSCs中总下调基因的32%),这意味着FOXD1在调节YAP缺乏诱导的早衰细胞衰老中起重要作用。同时,许多常见的下调基因在YAP – / – hMSCs中异位表达FOXD1时升高(图5G)。

图5

为了进一步阐明YAP – FOXD1与人类干细胞衰老的关系,作者引入了3种衰老细胞模型:复制衰老期(RS) hMSCs、成人早衰综合征(WS) hMSCs,及人骨髓RS BM-hMSCs。发现:YAP或FOXD1的过表达能使衰老的人间充质干细胞获得新生。

图6

第六步:YAP和FOXD1过表达可减轻小鼠创伤后骨关节炎

衰老细胞模型的研究到此已经十分通透了,最后一步就是上体内动物模型去验证作者的理论猜想了。鉴于YAP与FOXD1能够使衰老的间充质干细胞恢复活力,研究者推测关节内注射表达YAP或FOXD1的慢病毒载体可能对骨关节炎有治疗作用。并通过小鼠模型得到了验证:将编码YAP或FOXD1蛋白的慢病毒注射到患有骨关节炎的小鼠(前交叉韧带横切手术 ACLT)的关节腔内,发现数周的YAP或FOXD1基因治疗均可显著降低关节软骨中衰老细胞的比例,有效抑制关节软骨退化及关节腔炎症,从多个方面改善骨关节炎的病理表型。同时,YAP或FOXD1处理促进增殖标志物(Ki67、Aspm等)和软骨细胞分化相关基因(Col2a1、Acan等)表达(图7F),这为以后干细胞治疗骨关节炎奠定了一定的基础。

图7

纵观全文,整篇文章脉络清晰,逻辑严密,机制研究部分层层递进,动物模型细胞模型双重验证,KO/KD双管齐下,小编总结文章的主要亮点在于以下几点:

1、通过CRISPR/Cas9基因编辑技术对大片段的YAP、TAZ基因组完整的敲除,获得了完整的YAP-/-和TAZ-/-人胚胎干细胞,并成功诱导分化成了间充质干细胞。

2、发现了YAP-TEAD通路可以使衰老的MSC细胞重新获得新生从而缓解骨关节炎,并在3种衰老细胞模型中得到了验证,并在动物身上进行了基因治疗,这为以后干细胞治疗骨关节炎的临床研究提供了一定的实验基础。

唯一遗憾的是YAP-TEAD已加被研究得很透彻了,如果能重新发现一个新的通路调控细胞衰老就完美了。

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