如何解决 WB 非特异条带及高背景?问题排查+案例解析


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常有小伙伴抱怨:走过最长的路,就是 WB 实验的弯路。在上一期,我们的指南教大家如何应对常见的无条带或条带位置异常的问题。WB 实验时,还会遇到各种奇葩现象,比如非特异性条带和高背景,怎样才能获得背景干净的条带呢?这期我们继续来解疑。

非特异性条带,杂草丛生为哪般?

WB 显色后膜上有非特异条带或高背景是实验常见的问题,每一个实验细节可能会决定成败,例如抗体稀释液中 NaCl 成分和脱脂牛奶的比例就与非特异条带密切相关,下图的示例中,5% 脱脂奶粉和 0.5M NaCl 的体系下,非特异性条带更少。

利用 R&D Systems® 兔抗人 PTP1B 亲和纯化多克隆抗体(货号 AF1366)对 WB 实验进行优化。每个样本裂解 1×105 个细胞,并溶于 SDS 胶缓冲液进行 SDS-PAGE 蛋白分离:人 HeLa 细胞(Lane1)、MCF-7(Lane2)和 TF-1(Lane3)。电泳后,蛋白转膜至 Immobilon-P 膜,并在下述条件下免疫印迹,曝光时间为 30s。A,5% 脱脂奶粉封闭,一抗浓度:1.0 mg/mL,溶于 2% 脱脂奶粉和 0.15M NaCl;B,5% 脱脂奶粉封闭,一抗浓度:1.0 mg/mL,溶于 5% 脱脂奶粉和 0.15M NaCl;C,5% 脱脂奶粉封闭,一抗浓度:1.0 mg/mL,溶于 5% 脱脂奶粉和 0.5M NaCl。

除以上原因,其它与实验体系有关的原因及解决方法总结如下:

下面重点了解,与样品中目的蛋白特性有关的、需要考虑的因素:

比如目的蛋白表达水平低,为检测到目的条带,需要提高上样量,结果中易出现杂带。

以 PHD3 为例

其也被称为 Egl 9 homolog 3 (EGLN3),是一种广泛表达的脯氨酰羟化酶,理论分子量约为 27 kDa,它能羟基化靶蛋白如 HIF-1 alpha (Hypoxia-inducible factor) 上的脯氨酸残基。

在氧含量丰富的情况下,HIF-1 的 alpha 链会被 PHD 家族成员羟基化,从而导致其泛素化和降解。在低氧压力下,羟化反应减弱,HIF-1 alpha 亚基保留,HIF-1 得以入核,增加低氧相关基因的表达。

在典型的 HIF 信号通路中,PHD3 更多的影响 HIF-2 alpha。在大多数细胞类型中,HIF-2 alpha 受 PHD3 负调控,但有研究显示,在透明细胞性肾癌细胞 (ccRCC) 中 PHD3 高表达,并可维持 HIF-2 alpha 高表达。

所以,对于 PHD3、HIF-1 alpha 和 HIF-2 alpha 三种蛋白,通常在常氧条件下,在许多组织或细胞中表达量偏低,难以检测到,通常细胞需经过诱导后才可见表达量升高。如上图所示,使用 HIF-1 alpha Antibody (NB100-105) 检测由 CoCl2 诱导前和诱导后,Caki-1 细胞中 HIF-1 alpha 的表达。

使用 Novus Biologicals® 的 EGLN1/PHD2 Antibody (NB100-138) 和 EGLN3/PHD3 Antibody (NB100-139) 显示 HIF 羟化酶在原代大鼠肝细胞的细胞核和膜定位。以 COS-7 细胞核提取物作为对照,Normox:常氧条件,Hypox:缺氧条件,Reox:复氧条件 (图片来源:doi: 10.2353/ajpath.2006.060360)。

对此,针对 PHD3 的 WB 检测,有一些减少背景非特异条带的方法:

  • 降低上样量蛋白上样量过高,可能会导致高背景和非特异条带。

  • 建议不要使用 2% SDS(阴离子)裂解缓冲液处理样品。因为这种裂解液有时会导致抗体的背景升高。使用 NP-40 或 RIPA 最好。在 Novus 官网有裂解液中各种成分的说明,可以点击此处参考。另外,将样品在 95°C 下煮沸 5 分钟冷却后再上样更好。

  • 减少转膜时间(通常 90V/1h,甚至更少),因为较小的蛋白质(例如 PHD3)转膜速度会更快。

  • 将膜在室温下封闭 1 小时,洗膜 3 次,每次 5 分钟。封闭时间过长和过度洗涤会导致高本底并阻碍检测。

  • 用封闭液稀释一抗。前期验证发现 BSA 会引起该抗体产生高背景,所以我们建议使用封闭液 5% 脱脂牛奶稀释一抗。

  • 如果前期二抗工作浓度偏高,我们建议增加稀释比例,并只将二抗孵育 1 小时。设置去除一抗的对照实验以判断二抗的特异性。

值得注意的是,上表的因素中,由蛋白翻译后修饰(如糖基化等)、蛋白多亚型而出现的多条带,并不是非特异条带,需要根据文献及对照实验来多方面判断。

1. 由蛋白翻译后修饰造成的多条带现象

TREM2 (Triggering Receptor Expressed on Myeloid cells-2) 是一种细胞表面的受体糖蛋白,理论分子量约为 25 kDa。成熟 TREM2 包括一个 V-type Ig-like 胞外区域,一个跨膜区和一个短的胞质区。可溶形式的 TREM2 ECD 是由选择性剪接或蛋白水解产生,而细胞质区域可以通过酶裂解而释放。通过 Uniprot 数据库发现 TREM2 有 2 个糖基化位点,文献中 TREM2 呈现多条带且大于理论分子量,故推测为糖基化的 TREM2。

图片来源:Uniprot

WB 检测 THP-1 细胞裂解物中人 TREM2 的表达。用 0.2 μg/mL 山羊抗人 TREM2 抗原亲和纯化的多克隆抗体 (Human TREM2 Antibody,货号 AF1828) 和 HRP 标记的抗山羊 IgG 二抗 (货号 HAF109) 检测 PVDF 膜。在约 28 kDa 及以上的位置检测到多个条带(本实验在还原条件下,使用免疫印迹缓冲液 1 组)。

因此,如需在天然样品中检测未被糖基化的 TREM2,可尝试去糖基化实验,使用去糖基化试剂盒或使用 PNGase enzymes (Catalog # 9586-GH,9109-GH,7695-GHP)。后续排除非特异条带的干扰,可做只孵育二抗的阴性对照,更换封闭液(如将 BSA 换为脱脂牛奶),或者尝试 IP 实验。

2. 目的蛋白被酶切后产生不同亚型,造成多条带现象 

Brevican(也称为 BEHAB)是属于 lectican 家族的蛋白聚糖。Brevican 存在于中枢神经系统,由星形胶质细胞、少突胶质细胞和神经元表达。其中心 (GAG) 区域后端被截短,形成一个 GPI 锚定的剪接体。此外 Brevican 还可被多种蛋白酶水解,形成许多不同的短片段。如下图所示,在天然健康样品中可检测到两条带,推测为 Brevican 被蛋白酶裂解后的产物,约为 60 kD 和 90 kD。

WB 检测人小脑组织和人脑运动皮层组织的裂解物中 Brevican 的表达。用 0.1 µg/mL 绵羊抗人/大鼠 Brevican 多克隆抗体 (货号  AF4009) 和 HRP 标记的驴抗绵羊 IgG 多克隆抗体 (货号  HAF016) 检测 PVDF 膜。在大约 60 kDa 和 90 kDa 检测到 Brevican 的特异性条带(本实验在还原条件下,使用免疫印迹缓冲液组 1)。

高背景,条带去污小妙招

有时目的条带已隐约可见,但背景较深(如下图),这种情况虽也是实验操作或试剂造成,可能为膜的空白处与一抗或二抗结合、封闭剂未充分溶解、HRP 聚集等,但与非特异条带相比,容易改善,下面即为造成 WB 高背景的原因及改善方式。

又如:

1. 封闭时间不足

改善方式:增加封闭时间和/或温度,增加封闭剂的浓度(尝试增加至 10%),更改封闭剂(脱脂牛奶或 BSA),在抗体缓冲液中加入封闭剂(也可增加封闭剂浓度)。

2. 使用了错误的封闭剂

当检测磷酸化蛋白时,不推荐用脱脂牛奶作为封闭剂,因为牛奶和酪蛋白中富含磷酸化蛋白。

3. 抗体浓度偏高,导致非特异性结合

改善方式:降低一抗或二抗的浓度,在抗体缓冲液中加入封闭剂,做去除一抗的对照实验以判断二抗的特异性。

4. 清洗次数不足,非结合抗体未完全洗净

需要增加洗膜次数和/或洗膜时间。

5. 膜在实验过程中风干

确保膜在 WB 实验过程中不会变干。

6. 曝光时间过长

降低曝光时间,设置不同的检测时间点,逐步曝光。

7. 检测试剂太灵敏

在纯水中稀释检测试剂或使用灵敏度较低的检测试剂。

除此之外,对于 R&D Systems® 品牌验证过 WB 的抗体,通常会在产品页面给出检测体系建议,避免客户使用不合适的体系导致非特异条带和高背景。

Bio-Techne 旗下子品牌 R&D Systems® 和 Novus Biologicals® 拥有 10w+ 种一抗,在研发过程中,选择活性蛋白作为免疫原,经过严格的抗体验证。其中,经过基因敲除 (KO) 验证的 WB 抗体就将近 3000 种,极大地保障了抗体的特异性和实验的可重复性。

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