预实验 先测反应时间，1-4h，加入1000 2000 4000 8000 16000每孔细胞*5复孔 25孔的细胞

预实验决定第一天铺细胞的量和反应时间

铺完细胞，一天后加入反应10ul/孔，反应一定时间，吸上清去测，原孔板加入培养基继续培养。

注意事项

1. 需客户自行准备100%还原型Alamar Blue试剂。为得到还原型Alamar Blue，需配制Alamar Blue与细胞培养基的混合溶液，Alamar Blue与细胞培养基的比值为1:10，高压灭菌15 min。（不能对浓缩的Alamar Blue高压灭菌，也不能用PBS配制溶液，因为100%还原型Alamar Blue在PBS中不稳定。）

2. 为得到最好的结果，建议实验前先摸索孵育时间和接种细胞数量。

3. 合适密度的细胞可以增加检测灵敏度。对于96 孔板，我们建议每孔接种100 微升细胞，细胞浓度范围为：贴壁细胞在100-10,000/孔，悬浮细胞在2,000-50,000/孔，并以培养基为空白对照。对于384 孔板，细胞浓度和接种量均减半。

4. 整个过程均应为无菌操作，因为微生物污染物同样可以还原检测试剂而影响实验结果。

5. 注意接种细胞浓度和加入检测试剂后孵育时间。细胞浓度过高或孵育时间过长，会导致继发性还原反应，产生无色和荧光消失。

6. 孵育时，须避光。

7. 本产品可以使用荧光或分光光度计检测，但荧光的灵敏度高，实验误差小，推荐使用荧光检测。

操作说明

一、制作标准曲线（测定最佳孵育时间和细胞数量）

1. 每孔加入100微升细胞悬液（对数生长期细胞），对细胞计数。按比例依次用培养基等比稀释成一个细胞浓度梯度，一般要做3-5个细胞浓度梯度，每个浓度建议3-6个复孔。注：设置阴性对照：细胞培养基中不加入细胞；阳性对照：100微升100%还原型Alamar Blue（不含细胞）。

2. 每孔加入10微升Alamar Blue。阳性对照孔中加入10微升无菌的超纯水。

3. 放入细胞培养箱内培养（37℃,5% CO2）一定时间。培养基的颜色由靛青蓝开始变成粉红色就可以进入下一步。

4. 推荐用荧光分光光度计检测，激发光波长在530-560 nm之间，发射光波长为590 nm。

5. 普通分光光度计在570 nm测定吸光度，参考波长600nm。也可用570/630 nm和540/600 nm替代。

6. 绘制标准曲线。以细胞数量或孵育时间为横坐标（X轴），Alamar Blue还原率为纵坐标（Y轴）。根据此标准曲线可以测定出适合的细胞数量或孵育时间（使用此标准曲线的前提是实验的条件要一致）。

二、细胞毒性和细胞增殖检测

1. 每孔加入100微升细胞悬液（对数生长期细胞），对细胞计数。建议细胞数量为104/mL，具体每孔需要的细胞数量，需根据细胞类型决定。

2. 细胞中加入待检测药物，为检测药物对细胞增殖的作用，请设置合适的对照组，包括刺激细胞和非刺激细胞。

3. 混匀，放入细胞培养箱内孵育（37℃,5% CO2）一段时间。

4. 每孔加入10微升Alamar Blue。阳性对照孔中加入10微升无菌的超纯水。

5. 放入细胞培养箱内孵育（37℃,5% CO2）4-8 h，最佳孵育时间取决于细胞类型。培养基的颜色由靛青蓝开始变成粉红色就可以进入下一步。

6. 推荐用荧光分光光度计检测，激发光波长在530-560 nm之间，发射光波长为590 nm。

7. 普通分光光度计在570nm测定吸光度，参考波长600 nm。也可用570/630 nm和540/600 nm替代。

活力计算         

                                

1.普通分光光度计检测

Alamar Blue还原率（％）=[（E600×A570）-（E570×A600）]/[(E570′×C600)-E600′×C570] ×100

E570=氧化型Alamar Blue在570 nm波长的消光系数=80586；

E600=氧化型Alamar Blue在600 nm波长的消光系数=117216；

A570=检测孔在570 nm波长的吸亮度；

A600=检测孔在600 nm波长的吸亮度；

E570′=还原型Alamar Blue在570 nm波长的消光系数=155677；

E600′=还原型Alamar Blue在600 nm波长的消光系数=14652；

C570=阴性对照孔在570 nm波长的吸亮度（培养基，Alamar Blue，无细胞）；

C600=阴性对照孔在600 nm波长的吸亮度（培养基，Alamar Blue，无细胞）；

如果使用570/630 nm和540/600 nm作为替代，则：

E540=氧化型Alamar Blue在540 nm波长的消光系数=47619；

E630=氧化型Alamar Blue在630 nm波长的消光系数=34798；

E540′=还原型Alamar Blue在540 nm波长的消光系数=104395；

E630′=还原型Alamar Blue在630 nm波长的消光系数=5494；

2.荧光分光光度计检测

Alamar Blue还原率（％）= （实验组F590-阴性对照组F590）/（100%还原型阳性对照F590-阴性对照组F590）×100

F590=590 nm波长荧光值

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