[0020] 实施例1:

[0021] 使用本发明的方法单克隆了奶牛乳腺上皮细胞,具体方法如下:

[0022] (I)使用胰酶对对数生长期的细胞进行消化分离,用含10%的血清培养基终止消化。移液器反复吹打混匀悬浮细胞,使细胞成为单细胞悬液。如果吹打之后,仍有较多的细胞团,这时可以利用Η)ΤΑ进行分离消化4min,使细胞间的连接打开。接下来用胰酶再一次消化,这样单细胞较多。

[0023] (2)吸取2 μ I在步骤⑴中获得的细胞悬液,置于96孔板的一个孔的中央位置,小心放置于显微镜下,将物镜调至10倍镜下,数出2 μ I细胞悬液中的细胞总数,重复3次。如果2 μ I的细胞总数低于96个,则在根据2 μ I的细胞总数进行换算后,再吸取一定量的细胞悬液加入该孔的中央位置,直至该孔内的细胞总数为96个;如果2 μ I的细胞总数大于96个,则在根据2 μ I的细胞总数进行换算后,吸取该孔内一定量的细胞悬液,并将其移至另外一个孔的中央位置,直至原孔内细胞总数为96个。如果在该孔内出现细胞团,每个细胞团都将被视为I个细胞。

[0024] (3)在确定该孔内的细胞总数为96个后,从预先加入了 19.2ml培养基的“V”型储液槽中吸取200 μ I培养基至该孔内,反复吹打混匀,然后将此悬浮细胞培养基转移至“V”型储液槽,左右轻轻摇匀,使细胞分散均匀。

[0025] (4)用排枪吸取200 μ I的悬浮培养基至96孔板中,并在每次吸取的过程中,左右轻轻摇匀,防止细胞下沉。按照上述方法接种5块96孔板。

[0026] (5)待细胞培养24h之后,观察细胞的贴壁效果。同时,用倒置显微镜观察96孔板,标记出每孔只有一个细胞的孔。每隔3天换液一次,培养至一周并观察细胞的生长情况。如果有些孔没有细胞,再进行培养一周,这时候没有克隆出现就不会有细胞克隆出现。待细胞密度汇合至60%,将分离消化细胞转移至25cm2培养瓶进行扩大培养。

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