干货 | 免疫组化(IHC)实验从入门要高阶一篇搞定

BOSTER 5天前

免疫组化(IHC)作为实验达人的必备技能之一,它的实验流程和方法并不难,但在实验过程中存在许多变量,容易遇到各种问题,因此,想要做出漂亮的实验结果并非易事,正所谓“细节决定成败”。下面小博将根据多年的实战经验为大家介绍下IHC的相关知识及在实验过程中经常遇到的问题和应对策略,从此,让成败与细节Say“拜拜”!

No.1

免疫组化(IHC)检测原理

免疫组织化学(immunohistochemistry,IHC)是一门利用酶、荧光素、生物素、重金属离子等作为示踪剂,通过免疫亲和(抗原抗体特异性结合),在组织切片或细胞薄片上原位显示追踪生物体内大分子物质动态变化规律的实用性染色技术。按其主要示踪原理可以分为免疫组化(默认酶标法)、免疫荧光法、胶体金法等。

作用:通过颜色来显示蛋白质的有无、定位(胞外、胞膜、胞浆、胞核)、含量变化

样本种类:

按来源:①组织;②培养细胞

按制作方式:①石蜡片(IHC-P)②冰冻片(IHC-F)③细胞片(ICC)

No.2

免疫组化(IHC)常见问题

无染色

原因
解决办法
一抗和二抗不匹配
使用针对一抗的二抗(如一抗来自兔,二抗为抗兔抗体)
没有足够的一抗与目标蛋白结合
提高一抗用量。延长4℃孵育时间(如过夜)
由于不当储存、稀释或反复冻融造成一抗/二抗试剂盒失效
做阳性对照确认一抗/二抗试剂盒的有效性
样本中没有目标蛋白
建议做阳性对照
目标蛋白含量太少
应用信号放大操作
脱蜡不彻底
延长脱蜡时间,更换二甲苯
固定液封闭了抗体识别表位
缩短固定时间,加强抗原修复
蛋白位于细胞核内(核蛋白),抗体不能穿透核膜
对样本进行破膜通透处理
PBS缓冲液被细菌污染后破坏了靶蛋白的磷酸根
在抗体PBS储存液中加入适量防腐剂,或使用新鲜无菌的PBS

高背景

原因
解决办法
封闭不充分
选择合适的封闭液,延长封闭时间
一抗浓度过高
针对一抗做浓度梯度实验,选择合适浓度
孵育温度过高,时间过长
选择4℃过夜或缩短孵育时间
二抗质量不佳
不加一抗,做二抗对照,选择合格二抗
组织冲洗不彻底
加强洗涤
内源性过氧化物酶含量过高
延长3%H2O2灭活时间或用0.5%高碘酸溶液室温孵育10min
固定过度
改变抗原修复方法或减小抗原修复强度。
信号过度放大
缩短抗体孵育时间
通透作用破坏膜并除去了膜蛋白
去除缓冲液中的通透剂
显色底物过量或显色时间太长
缩短底物孵育时间

非特异性染色

原因
解决办法
一抗/二抗浓度过高
降低抗体浓度和或缩短孵育时间
存在内源性过氧化物酶活性
延长3%H2O2灭活时间或用0.5%高碘酸溶液室温孵育10min
一抗与被染组织同源(如用鼠一抗检测鼠组织),加二抗后,二抗会与同源的所有组织结合
应用与组织非同源的一抗
切片/细胞变干
保持切片/细胞湿度,切勿变干。

No.3

免疫组化(IHC)实验流程

那么,怎样才能做出漂亮的染色结果呢?为了有一个全局概念,我们先来看一下石蜡切片免疫组化的实验流程吧!每一步都存在许多决定成败的小细节,它们可以是陷阱,也可以是获得好的实验结果的基石。

【免疫组化总流程图,点击查看大图】

01

取材如何操作

√ 快:尽量半小时内取材完成

√ 准:刀、剪锋利,一步到位轻夹轻放

√ 大小:1cm X 1cm X 0.2cm左右最宜

02

固定的注意事项

√ 何时固定?——取材后立刻!马上!

√ 用什么固定?——4%多聚甲醛。有致密外膜用Carnoy液,活检用Bouin液

√ 固定液用多少?——组织体积20倍以上最宜。量少应中途换液1-3次 

√ 固定多久?——6-24h最佳。固定越久所需修复强度越大,越容易出现自发荧光及非特异性染色。

03

选石蜡片还是选冰冻片?

√ 要保存简单 ——选石蜡片 !

√ 要速度快 ——选冰冻片!

√ 要结构漂亮 ——选石蜡片!

√ 抗原不稳定 ——选冰冻片!

√ 抗原稳定 ——石蜡片冰冻片皆可!

04

切片烤片如何操作?

√ 切多厚?

石蜡片3-8μm,一般5μm;冰冻片5-15μm,一般8μm

√ 怎么捞片?

水温40-45℃,组织平整后玻片有油漆的一面贴近组织向斜上方提起

√ 烤多久?

37℃过夜 或  60℃   1-2h

注意:使用防脱处理的玻片

05

脱蜡步骤

Step 1:二甲苯

Step 2:二甲苯

Step 3:二甲苯

Step 4:100%酒精

Step 5:85%酒精

Step 6:70%酒精

注:浸泡时间是每缸10min

06

06

灭活:3%H₂O2灭活做还是不做?

√ 内源性过氧化物酶在血管瘤、肝、胎盘、阑尾炎,坏死区域

和急性炎症组织含量较高

√ 显色系统为过氧化物酶(HRP)系统,该步骤建议一定要做

√ 碱性磷酸酶(AP)系统以及免疫荧光,该步骤可以不做

√ 在灭活时,如组织片中出现细小且密集的气泡,表示过氧化物酶含量过高,这时用3%H₂O2溶液难以完全阻断,可以用0.5%高碘酸溶液室温条件孵育10min

07

抗原修复

√ 抗原修复方式:酶修复、高压热修复、微波热修复,都能得到更好的效果

√ 消化酶的选择:需格外注意的各种消化酶的最佳工作PH值

√ 修复液的选择:柠檬酸盐缓冲液(PH6.0)和EDTA(PH8.0或9.0)修复液

经验证,对于大多数的抗体来说后者使用效果更优

√ 消化酶的选择:固定时间越久,修复强度越强,旧标本修复强度强于新鲜标本

08

封闭

√ 5%BSA是最常用

√ 血清,效果最全面

√ 封闭血清与二抗同源,与一抗不能同源

09

抗体孵育

√ 单抗和多抗各有优势,按需选用

√ 一抗4℃孵育效果最佳,备选37℃ 1-2h

√ 二抗需与一抗的种属、类别或亚类相匹配,推荐驴,山羊,绵羊等种属

√ 二抗/SABC 一般 37℃ 孵育30 min 

10

显色

√ DAB显色液现用现配

√ 建议镜下控制反应时间

√ 根据显色时间反向优化实验条件

11

复染/返蓝

√ Mayer`S 苏木素复染(不易过染)

√ 碱性溶液返蓝(如氨水、饱和磷酸氢二钠溶液等)

√ 免疫荧光用DAPI染核

12

脱水透明

Step 1:70%酒精

Step 2:85%酒精

Step 3:100%酒精

Step 4:二甲苯

Step 5:二甲苯

Step 6:二甲苯

13

封片

√ DAB显色用中性树胶封片

√ 免疫荧光建议用抗荧光衰减封片剂

√ AEC显色用水溶性封片剂

14

对照的设置

√ 阳性对照:主要用于验证实验流程有没有问题,各试剂质量是否过关,多用已有明确蛋白表达的组织

√ 阴性对照:确认染色结果的特异性,要用非相关抗体

√ 空白对照:用以排除非特异背景染色,一般多用一抗来源的动物血清

15

抗原定位

√ 胞膜型表达:

阳性染色颗粒主要定位于细胞膜表面。常见的有淋巴细胞膜抗原(如LCA、CD20、CD4、CD8等)、间皮细胞抗原(如MCA、CR、CK5/6等)、细胞膜受体(insulinR、FAS、CD25等)、黏附分子(整合素、干扰素、钙黏蛋白等)、上皮细胞抗原(EMA、ECA、ESA等)等。

√ 胞核型表达:

阳性颗粒定位于细胞核中。常见的有增殖细胞周期抗原(Ki-67、PCNA等)、性激素受体(ER、PR、AR等)、肿瘤相关基因(P53、P27、BRCA1等)、肌核抗原(Myf-3、MyoD1等)、淋巴细胞核抗原(OCT-2、MUM1等)、上皮细胞核抗原(P63、TTF-1等)等。

√ 胞质型表达:

阳性颗粒定位于细胞质。常见的有细胞结构蛋白 (中间丝蛋白、微丝蛋白等)、细胞内酶和功能蛋白(MPO、NSE、PLAP等)、神经内分泌物(GH、PLR等)等。

√ 胞膜-质型表达:

阳性颗粒分布于细胞质和细胞膜。常见的有肿瘤相关抗原(如CA家族抗原)、间皮标志物(MCA、CR等)等。

√ 胞核-质型表达:

阳性颗粒分布于细胞核和细胞质。常见的有S-100、HMB45、Melan A、HSP27、MLH1等。

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数据库推荐

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量化分析

√ 阳性着色细胞计数法:

在40*光镜下,随机选择不重叠的3-5个视野,人工或机器计数阳性着色细胞和总细胞数,比较阳性细胞比率

√ 灰密度分析法:

通过在不同组别和不同动物组织切片上选择相同区域相同条件下image j进行灰密度分析,然后进行统计分析即可

√ 评分法:

通过在光学显微镜下对组织切片分别按染色程度(0-3分为阴性着色、淡黄色、浅褐色、深褐色)、阳性范围进行评分(1-4分为0-25%、26-50%、51-75%、76-100%),最终可以分数相加,再进行比较。

免疫组化(IHC)中存在的细节性问题“千千万”,每一种都有可能影响实验的成败,以上篇幅限制,如果你还想更深入的学习IHC相关问题,可扫码观看我们前两期开展的《IHC/IF实验课堂》直播课,该课程由我们博士德非常资深的组化实验专家全面讲解,深度分析,帮助你轻松搞定免疫组化的“疑难杂症”!

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