Nature争鸣| 裸鼹鼠抗癌能力之争：HRAS表达量可能是关键决定因素
撰文 | 十一月
责编 | 兮
裸鼹鼠（Heterocephalus glaber）与其他相似体型动物相比具有明显更长的寿命，最长可达到30年，而相似身体指数（Body mass）的实验室小鼠最长寿命不过4-6年【1】（图1）。除了长寿之外，裸鼹鼠还表现出一种不寻常的抗癌能力。多年来对裸鼹鼠细胞中的观察中科学家们没有发现任何癌症发病率【2,3】。但是一直以来对于裸鼹鼠抵抗癌症发生的具体机制还不得而知。
图1 不同身体指数的动物的寿命
2013年7月，美国罗彻斯特大学Andrei Seluanov与Vera Gorbunova研究组合作发文题为High-molecular-mass hyaluronan mediates the cancer resistance of the naked mole rat，发现体外培养的裸鼹鼠成纤维细胞会分泌大量的高分子量透明质酸（High-molecular-mass hyaluronan, HMM-HA），作者们证实这正是裸鼹鼠能够抵抗癌症发生的重要原因。该文章的结论可能会为临床方面通过促进HMM-HA的分泌或者抑制其降解通路而为预防癌症和延长寿命提供可能的参考思路，该成果点燃了人们对于裸鼹鼠抗癌的机制研究的兴趣，成为当期封面文章。
2013年7月Nature封面
在2009年，Gorbunova与Seluanov研究组曾经发表过一篇PNAS文章鉴定出裸鼹鼠中存在一种新颖的抗癌机制被称为早期接触抑制（Early contact inhibition, ECI）【4】。接触抑制是一种强大的抗癌机制，但在癌细胞中接触抑制已经消失。裸鼹鼠细胞生长停滞的密度比小鼠细胞低得多，而ECI的缺失使细胞更容易发生恶性转化【4】。
然而，触发裸鼹鼠ECI的信号仍然未知。在Gorbunova与Seluanov研究组培养多个来自裸鼹鼠中成纤维细胞品系时，作者们发现培养基会在几天之后变得非常粘。通过对培养基的粘性测量，作者们发现相比于人类、豚鼠以及小鼠细胞来说，裸鼹鼠成纤维细胞培养基的粘性更高。而培养基粘性升高的原因是由于HMM-HA分泌显著升高。但并不是所有的裸鼹鼠细胞都具有如此的特性，裸鼹鼠胚胎时期成纤维细胞则不会表现出ECI的特性同时培养基的粘性也没有明显地升高。透明质酸合成酶在脊椎动物进化过程中高度保守，人和小鼠之间透明质酸合成酶HAS2具有98.7%的同一性和100%的相似性。两个100%在哺乳动物中HAS2中保守的天冬氨酸在裸鼹鼠中被丝氨酸取代。这种基因变化在其他储存在基因库中的哺乳动物包括裸鼹鼠进化相近的豚鼠HAS2基因中都没有出现。该独特的氨基酸变化可能与酶活性相关，同时也是裸鼹鼠HAS2具有持续合成能力的原因。当作者们将裸鼹鼠HAS2基因在HEK293细胞中过表达时，HMM-HA开始分泌。
除了合成酶的活性可能会影响透明质酸的分泌，高分子量透明质酸的含量还会受到透明质酸降解酶HAases的调节【5】。作者们通过测量裸鼹鼠、人类、豚鼠以及小鼠细胞中HAase酶活性发现，裸鼹鼠中HAase酶活性相较于其他种类的细胞明显较低。因此，总的来说裸鼹鼠中成纤维细胞中HMM-HA的积累是由于HMM-HA稳健的合成以及更慢的降解。而且作者们发现裸鼹鼠中ECI主要是由HMM-HA-CD44受体-NF2信号通路所调控的。
那么，作者们想要检测裸鼹鼠细胞在抵抗肿瘤细胞恶性转化过程中HMM-HA发挥的作用。H-Ras V12与SV40 LT足够促进小鼠成纤维细胞的恶性转化【6】，在2009年的那篇PNAS文章中，作者们证实了此组合并不足以引起裸鼹鼠成纤维细胞的非贴壁型生长【4】。通过HAase降解HMM-HA和通过抗体阻断CD44受体使得裸鼹鼠对H-Ras V12与SV40 LT组合触发恶性转化变得敏感。
在小鼠中进行了肿瘤外植体实验中同样证明了该结论，发现HAS2产生的HMM-HA对于提高裸鼹鼠的抗癌特性具有非常关键的作用。另外，裸鼹鼠细胞中分泌的HMM-HA可能是裸鼹鼠在进化过程中为了适应地下生活为皮肤的灵活挤压通过地下通道而产生的特征。因为在另外一种地下啮齿类动物盲鼹鼠中也出现了大量分泌的HMM-HA，而盲鼹鼠在系统发育上更接近大鼠和小鼠而非裸鼹鼠。
总的来说，Gorbunova与Seluanov研究组的工作揭开了裸鼹鼠通过大量分泌高分子量透明质酸来降低H-Ras V12与SV40 LT组合触发的恶性肿瘤转化过程，提出了裸鼹鼠抗癌的具体分子机制，为预防癌症和延长生命开辟了新的途径。
但是关于该文章的结论，2020年7月1日，英国剑桥大学Walid T. Khaled与Ewan St John Smith研究组发出了质疑，在Nature上发表他们关于裸鼹鼠中恶性肿瘤转化的实验数据，文章题为Transformation of naked mole-rat cells。与Seluanov与Gorbunova研究组（此后称为美国团队）结果截然不同的是，Khaled与Smith研究组（此后称为英国团队）发现裸鼹鼠细胞对SV40LT与HRASG12V组合引发的肿瘤转化过程非常敏感，因此英国团队提出裸鼹鼠中抗癌的具体分子机制可能是由于存在一个非细胞依赖的机制而非先前美国研究组发现的高分子量透明质酸的作用机制。
随着裸鼹鼠基因组数据的发表【7】以及CRISPR-Cas9基因编辑技术的发展【8】，英国团队希望鉴定出裸鼹鼠中癌症抵抗机制的具体决定性基因。英国团队依照美国团队发表的关于裸鼹鼠细胞抵抗SV40LT与HRASG12V组合引发的恶性肿瘤转化的实验进行了重复。
首先，英国团队使用两个不同的启动子Pgk1与EF1A将SV40LT与/或HRASG12V的sgRNAs通过慢病毒载体运送进入裸鼹鼠细胞中。通过使用慢病毒载体，英国团队共建立了从11只裸鼹鼠中5个不同器官(肠、肾、胰腺、肺和皮肤)中得到的不同细胞系。通过对这79个细胞系进行检测，英国团队发现同时表达SV40LT与HRASG12V的细胞会产生明显的肿瘤细胞克隆。
进一步地，英国团队希望通过将SV40LT与HRASG12V的裸鼹鼠细胞转入免疫缺陷型小鼠中检测这些细胞的致瘤潜能。英国团队发现在SV40LT与HRASG12V的裸鼹鼠细胞在细胞注射后的5天即开始出现肿瘤体，而对照以及SV40LT单独的裸鼹鼠细胞即使是在细胞注射后60天后也不会出现肿瘤。
为了探究与美国团队出现实验现象不符的原因，英国团队从美国团队处获得了详细的实验材料和实验方法。但是同样地，英国团队发现SV40LT;HRASG12V转染细胞系无论是在体外还是在外植体中均会出现明显的肿瘤细胞克隆和肿瘤体。
为了进一步调查这些矛盾结果出现的原因，英国团队使用美国团队使用的完全相同的启动子SV40E和CMVIE构建sgRNA慢病毒载体。除此之外，英国团队还将裸鼹鼠细胞培养基DMEM换成了与美国团队完全一样的EMEM培养基。但是无论是体外实验还是外植体实验再次确认了英国团队的结果：SV40LT;HRASG12V组合转染裸鼹鼠细胞对恶性肿瘤转化的敏感性降低。
在排除了启动子、培养基以及慢病毒介导的突变对于此矛盾结果的影响之后，英国团队通过使用美国团队相同的瞬时表达载体进行转染。英国团队使用同样的实验方法分别转染了原代裸鼹鼠细胞和小鼠皮肤细胞。
他们发现与美国团队发表的结果不同的是，从小鼠皮肤细胞中拿到的细胞没有出现明显的肿瘤克隆，可以解释美国团队使用多种瞬时表达载体而不使用抗生素筛选将SV40LT;HRASG12V组合导入原代细胞，这是一种非常低效的引入外源癌基因的方法。
根据这些结果，英国团队得出结论即裸鼹鼠细胞对于SV40LT;HRASG12V组合的导入引发的恶性肿瘤转化过程没有抵抗能力。裸鼹鼠细胞抗癌的关键机制是非细胞自主的，也可能由细胞独特的微环境和/或免疫系统【9】所解释。因此英国团队希望大家了解该文章中的发现，希望对理解裸鼹鼠卓越的生物学和癌症抵抗能力的机制的研究方向进行拨乱反正。针对英国团队的质疑，美国团队在同期Nature杂志上进行了回复。
首先，美国团队提出裸鼹鼠细胞对SV40LT;HRASG12V组合诱导的恶性肿瘤转化相较于小鼠细胞具有更高的抵抗性并非孤例，有其他独立的研究组得到过相似的结果【10】。英国团队与美国团队实验的关键不同在于驱动HRAS表达启动子的强度不同。
美国团队在最初的文章中驱动基因表达使用的是逆转录病毒LTR（Long terminal repeat）启动子，该启动子在许多其他肿瘤发生研究被广泛使用【6,11-13】。但是相反的，英国团队使用的CMVIE、SV40E、Pgk1以及EF1A都是更强的启动子。因此，美国团队认为导致两方结果不同的原因可能是由于基因表达水平的不同。
前人的研究发现HRAS（G12V）表达量不同决定了人类细胞的转化【14】。因此，美国团队想知道在裸鼹鼠细胞中HRAS（G12V）的高表达是否会引起英国团队看到的现象以及解释实验分歧的原因。美国团队使用CAG启动子驱动HRASG12V的表达，将其整合到SV40LT表达的细胞中。
在检测HRAS（G12V）表达量后，美国团队发现在CAG启动子的驱动下HRAS（G12V）表达量明显升高，同时促进肿裸鼹鼠细胞中肿瘤产生的能力也大大增强。但是原始的文章中所使用的启动子驱动下，HRAS（G12V）表达量较低并且裸鼹鼠细胞相较于小鼠细胞对致癌转化具有更强的抵抗能力。
图2 CAG强启动子促进HRAS(G12V)表达量升高导致裸鼹鼠细胞抗癌能力变弱
英国团队在重复美国团队的实验时还发现裸鼹鼠LTR-SV40LT;HRASG12V细胞系克隆效率较低和肿瘤潜伏期较长，这可能是由于在引入SV40LT和HRASG12V后传代过程中在一小部分细胞群体中积累了额外的遗传变化，它们克服了裸鼹鼠细胞的如抑制RAS信号通路和透明质酸屏障的肿瘤抑制机制。这些结果都说明裸鼹鼠细胞的确相比于小鼠细胞具有更强的抗癌能力，但是这种差异只有在癌基因表达水平中等时才能出现，人为的高RAS表达量可能会压倒裸鼹鼠中存在的天然抗癌机制。原文链接
https://www.nature.com/articles/nature12234
https://doi.org/10.1038/s41586-020-2410-x
https://doi.org/10.1038/s41586-020-2411-9
制版人：琪酱
参考文献
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