《新英格兰医学杂志》：RNA疫苗的应用、机制和优化策略

Deborah H. Fuller, Ph.D., and Peter Berglund, Ph.D.

N Engl J Med 2020; 382:2469-2471

20世纪90年代早期，科学家通过将核酸（RNA或DNA）直接注射入小鼠肌肉内的方式实现了其所编码蛋白的体内表达[1]。还有研究表明，将编码病原体蛋白的DNA递送到小鼠皮肤或肌肉内可诱导产生免疫应答，进而避免感染。这些发现为疫苗学的一个新领域播下了种子，使我们只需要病原体蛋白编码基因的编码序列即可制造疫苗。早期研究表明，DNA和RNA疫苗均可诱导产生免疫应答。通过质粒（小的环状染色体外DNA分子）递送是最初的主要递送策略；虽然首批人体临床试验大多令人失望，但递送策略的进展和免疫刺激序列（遗传佐剂）的引入推动了新的临床试验，并为SARS-CoV-2（Covid-19致病病毒）疫苗的研发策略提供了指导。

最近，提高mRNA稳定性和蛋白生成量并且改进递送效果的新方法激发了人们对信使RNA（mRNA）疫苗的兴趣。这些方法包括使用修饰核苷酸和开发纳米颗粒递送技术，该技术可稳定mRNA、增强细胞摄取并在mRNA进入细胞后提高其生物利用度。mRNA避免了整合入宿主基因组的风险，这被视为mRNA与DNA疫苗相比的一个相对优势，但大量研究已经减轻了人们对DNA疫苗的这一担忧。mRNA疫苗的一个明显优势是，与DNA疫苗不同，它们并非进入细胞核才能表达抗原。而DNA疫苗进入细胞核后将产生许多mRNA分子，使每个转染细胞产生更多抗原。因此，人们对自我扩增型RNA疫苗颇感兴趣，Beissert等[2]曾介绍了用这类疫苗提高mRNA疫苗所表达抗原产量的策略。

自我扩增型RNA疫苗来自甲病毒属的基因组主链，其含有完整的编码病毒RNA复制机制基因，但编码病毒结构蛋白的基因被编码疫苗抗原的转基因取代[3]。自我扩增型RNA疫苗能够以质粒DNA、病毒样RNA颗粒和体外转录RNA的形式递送（图1），而且诱导产生的免疫应答比mRNA诱导产生的免疫应答强得多[4]。自我扩增型RNA疫苗具有免疫原性，可以使用合成制剂，且其生产规模可极大扩增，因此该方法非常具有吸引力。基于DNA质粒的自我扩增型RNA疫苗结合了两方面优势：DNA核酸制品的更高稳定性，以及自我扩增型RNA疫苗的更高抗原表达水平；此类疫苗在临床前模型中诱导产生的免疫应答比传统DNA疫苗诱导产生的免疫应答更强[5]。

图1. 通过甲病毒属复制子RNA获得抗原表达

质粒DNA携带复制酶基因（编码可复制RNA的蛋白质）和转基因（编码疫苗抗原）进入细胞核，在细胞核内转录，生成复制子RNA（编码复制酶蛋白的部分）。然后复制子RNA被转运到细胞质内，之后RNA自我复制（也称为自我扩增），生成信使RNA（mRNA），然后被翻译成疫苗抗原（红色）（图A）。在病毒组装步骤（图中未显示）中产生的病毒样RNA颗粒通过受体介导的胞吞作用将复制子RNA递送到细胞质内（图B）。体外转录的复制子RNA在盐水或合成制剂中被递送到细胞内（图C）。在每种方法中，复制酶蛋白复合物都是从复制子RNA基因组上游三分之二处开始翻译（紫色）。复制酶利用3′非翻译（NTR）区（绿色）开始负链（-RNA）的转录（RNA依赖性RNA聚合酶介导的转录），并利用-RNA作为模板，从5′ NTR区（绿色）开始转录正链（+RNA），并且利用亚基因组启动子（箭号）启动mRNA的转录。许多抗原蛋白（Ag）是由细胞质核糖体从mRNA直接翻译而来。最近Beissert及其同事[2]描述了一种双重策略，即编码编码复制酶的复制子RNA与共同递送的抗原编码RNA呈“反式”（图D）。作者发现当复制酶基因侧翼有用于促进胞内复制的NTR区时，会产生免疫原性（图E）。他们观察到，对复制酶基因的翻译效率进行优化后（并且缺乏侧翼区），免疫原性增强。CGMP表示现行《药品生产质量管理规范》（Current Good Manufacturing Processes）。

Beissert等描述了一种采用两种RNA载体的策略，一种载体保留复制酶编码基因，另一种载体编码抗原。因此，复制酶机制是通过自我扩增型RNA或非复制型mRNA以“反式”（即两种基因共同作用，但作用于不同的RNA）方式提供的，并介导抗原编码RNA的复制。作者发现，使用表达纳克剂量流感蛋白血凝素的抗原编码RNA使小鼠免疫后，可诱导小鼠产生很强的保护性中和抗体应答，但所需的复制酶编码RNA数量相对较大。

与传统的自我扩增型RNA疫苗相比，这种方法在提高安全性、可制造性和容易优化方面具有关键优势。安全性方面的优势源自使用了两种RNA，之前的自我扩增型RNA被制成可表达具有出芽能力的病毒糖蛋白，这些糖蛋白理论上可以进入细胞外囊泡并转移到新的宿主细胞，而使用两种RNA就避免了这一风险。在可制造性方面，扩大制造规模对于很长的RNA转录物（例如自我扩增型RNA）而言可能有难度，而通过反式扩增方法，我们可以使用较短的RNA。但该方法有两个潜在缺陷：首先我们需要制造两种RNA药物，其次由于需要在体内将两种药物高效递送到同一细胞内，因此增加了复杂性。最后，正如Beissert等所指出的，这一方法还可以得到进一步改进，方法是在mRNA技术中实施新策略，例如核苷酸修饰、稳定序列以及对整个复制子基因的密码子优化，而这些策略目前在传统的自我扩增型RNA中都无法实现。

Covid-19全球大流行发生之后，mRNA疫苗率先进入临床试验，首批志愿者在SARS-CoV-2基因序列发布后10周内接种了疫苗（www.modernatx.com/modernas-workpotential-vaccine-against-covid-19）。要解决这场大流行危机，目前主要寄希望于核酸疫苗。这一点在我们意料之中。在最早期的构想阶段，核酸疫苗就被认为是快速应对大流行的一种可能解决方案。核酸疫苗只需要病原体序列即可制造，而且制造过程简单，这两点一直被认为是核酸疫苗在快速应对新出现的流行病方面的巨大能力。自我扩增型RNA疫苗和现在的反式扩增型RNA疫苗能够在体内扩增和持久地产生抗原，而且具有强大的内在固有免疫刺激特性，进一步增强了核酸疫苗的能力，而且有可能节省剂量（即用较小剂量的疫苗获得相同的免疫应答）。

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